微生物遗传变异与育种.ppt

第六章微生物的遗传变异和育种,在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程中，要想有效地大幅度提高产品的产量、质量和花色品种,首先必须选育优良的生产菌种，才能达到目的。而优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立的两个方面，在一定条件下，二者是相互转化的。认识和掌握微生物遗传变异的规律是搞好菌种选育和关键。,Contents第一节遗传变异的物质基础一、遗传物质化学本质的确证二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式第二节基因突变与诱变育种一、基因突变二、突变与育种,Contents第三节基因重组和杂交育种一、原核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组第四节基因工程一、基因工程的基本操作二、基因工程的应用,Contents,第五节菌种的衰退、复壮和保藏一、菌种的衰退和复壮二、菌种的保藏,遗传(Heredity,Inheritance)一切生物体最基本的属性之一生物的亲代传递给子代一套遗传信息的特性。即子代与亲代在形态、生理等方面的相似性。遗传型（基因型Genotype）生物体所携带的全部遗传因子或基因的总称遗传性代表了可能性，在环境条件的作用下为表型表现型（现实型Phenotype）具有一定遗传型的个体在特定的外界环境中，通过生长发育所表现出来的种种形态和生理特征的总和遗传型+环境条件表型,变异（Mutation）生物体在某种外引或外因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。发生几率极低，性状变化幅度大，新性状稳定可遗传。变异的特点：a。群体一般为10-610-10；b.形状变化的幅度大；c.变化后形成的新性状是稳定遗传的。,饰变（Modification）一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表性变化。饰变的特点：发生几率高,几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化；性状变化幅度小；因遗传物质不变，故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。同一遗传型的生物在不同外界条件下所呈现的表现型的差异,突变与饰变的实例Serratia,粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens产色素与温度有关粘质沙雷氏菌，在25下培养时，会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成似鲜血那样。可是，当培养在37下时，群体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至25，产色素能力又得到恢复。只有遗传型的改变，即生物体遗传物质结构上发生的变化，才称为变异。,微生物作为模式生物生物学特性,模式生物物质与代谢类型的多样性个体体制极其简单营养体一般都是单代谢物或终产物菌落形态的可见性和多样性环境条件作用的直接性和均一性容易形成营养缺陷型菌株相应的病毒存在于进化过程中原始有性生殖方式,第一节遗传变异的物质基础,一、遗传物质化学本质的确证,TransformationexperimentofS.pneumoniae肺炎链球菌转化试验byF.Griffithin1928噬菌体感染试验植物病毒重建实验,1、肺炎双球菌转化试验,Streptococcuspneumoniae肺炎双球菌的特性光滑型（Smooth,S型）荚膜，人肺炎，鼠败血症粗糙型（Rough，R型）无荚膜，无毒动物实验细菌培养实验S型菌的无细胞抽提液试验,经典转化实验,question？,在加热杀死的S型细菌细胞中可能存在一种具有遗传转化能力的物质，能通过某种方式进入R细胞，并使R型细胞获得表达S型荚膜性状的遗传特性。到底是什么物质呢？活的、非致病性的R型从已被杀死的S型中获得了遗传物质，使其产生膜成为致病性的S型。Griffith将这种现象称为转化(transformation),TransformingPrinciple实验,离体条件下的转化实验1944年O.T.Avery,活R菌+加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白质加S菌的荚膜多糖,长出S菌,只长R菌,conclusion,只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。-DNA,2、噬菌体感染实验,A.D.Hershey,M.Chasein1952含有32PO43-或35SO42-作为磷源和硫源的组合培养基32PDNA核心噬菌体35SProtein外壳噬菌体,噬菌体的感染实验,1952年侯喜(A.Hershey)和蔡斯(M.Chase)利用示踪元素，对大肠杆菌T2噬菌体进行了这类实验。先用含有35S和32P两种元素的培养基培养大肠杆菌，然后让T2噬菌体侵染培养后的大肠杆菌，从而使T2噬菌体打上35S和32P的标记。让这种T2噬菌体侵染不含标记元素的大肠杆菌，并在T2噬菌体完成了吸附和侵入后，强烈搅拌洗涤，以便使吸附在菌体外表的T2噬菌体蛋白质外壳脱离细胞并均匀分布，再进行离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。结果发现，几乎全部35S都在上清液中，而几乎全部32P和细菌一起出现在沉淀物中。,10分钟后用捣碎器使空壳脱离,吸附,离心,沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体,噬菌体感染实验,含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中,从上述实验中可以看出，在噬菌体的感染过程中，其蛋白质外壳未进入宿主细胞。进入宿主细胞的虽只有DNA，但经增殖、装配后，却能产生一大群既有DNA核心又有蛋白质外壳的完整噬菌体颗粒。有力证明：在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳的在内的整套遗传信息。,3、植物病毒重建试验,TobaccomosaicvirusTMV,H.Fraenkel-Conrat烟草花叶病毒TMV霍氏车前草花叶病毒HRV苯酚溶液中振荡分离蛋白质外壳和RNA核心,烟草花叶病毒的拆开与重组实验,1956年，美国的法朗克-康勒特(Fraenkel-Conrat)将烟草花叶病毒拆成RNA(因该病毒不含DNA)和蛋白质，并分别对烟草进行感染实验；结果发现只有RNA能感染烟草，并在感染后的寄主中分离到完整的具蛋白质外壳的烟草花叶病毒。后来他又将甲、乙两种变种的烟草花叶病毒拆开，在体外分别将甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白质结合，将乙病毒的RNA和甲病毒的蛋白质结合进行重组。接着他把这些经过重组的病毒分别感染烟草。结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的RNA。证明了核酸(RNA)是烟草花叶病毒的遗传物质基础。,植物病毒重建试验,结论,通过这三个具有历史意义的经典实验，得到一个确信无疑的共同结论:只有核酸才是负载遗传信息的真正物质基础,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,遗传物质在7个水平上的形式细胞水平细胞核水平染色体水平核酸水平基因水平密码子水平核苷酸水平,1、细胞水平,生物体DNA大部分或几乎全部存在与细胞核（真核）或核质体（原核）中不同微生物细胞，细胞核数目不同单核S.cerevisiae、A.niger、A.nidulansetal，孢子双核杆菌细胞存在两个核区（球菌一般一个）多核N.crassa、A.oryzae、藻状菌、放线菌,2、细胞核水平,基因组、核基因组或核染色体组真核生物核膜包裹，DNA与组蛋白结合形成染色体（光学显微镜可见）原核生物无核膜包裹，DNA裸露，环状双链广义质粒核外染色体真核生物质粒细胞质基因：线粒体、叶绿体共生生物（草履虫放毒者品系）：KappaParticle2m质粒（酵母菌质粒位于核内，不与核染色体组整合）原核生物质粒：F因子、R因子、Col质粒等,细胞核水平,细菌染色体(左）和质粒（右）,3、染色体水平,染色体数目人：23；水稻：12；大肠杆菌：1；酿酒酵母：16-17；枯草芽孢杆菌：1染色体倍数：同一细胞中相同染色体的套数真核生物：多条染色体，单倍体、双倍体原核生物：一条裸露的DNA构成的环状染色体单倍体Heploid细胞仅包含有一套染色体的个体。如多数微生物、高等动植物的生殖细胞双倍体：细胞含有两套功能相同的染色体的个体。如多数高等动物、植物体细胞、啤酒酵母营养细胞、合子等,一些真核生物和原核生物的染色体DNA,1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组特点,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5106bp，分布在16条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；4）重复序列多；,3、原核生物和真核生物的基因组比较,代表性真核和原核生物染色体基因组,4、核酸水平,核酸种类多数生物遗传物质为DNA，少数病毒为RNA原核DNA裸露真核DNA被包裹，与组蛋白结合在一起核酸结构DNA双链、单链；RNA单链、双链环状、线状、超螺旋DNA长度：基因组的大小，单位：bp、kb、mb微生物基因组测序,遗传物质DNA的分子结构及其多样性,一般认为DNA的双螺旋分子结构是一律的，是由4种脱氧核糖核酸变化排列组成的大分子。但各种生物DNA的4种碱基（base）含量往往是不均等的，而且在各种生物中这4种碱基的含量之比反映着种的特性。各种微生物中的A=T，G=C。A为腺嘌呤核苷(adenosine)，T为胸腺嘧啶核苷(thymidine)，G为鸟嘌呤核苷(guanosine)，C为胞嘧啶核苷(cytidine)。但G+C/A+T则随着微生物的种类不同而不同，这数值小到0.45，大到2.73。,DNA螺旋体DNA结构模式,DNA分子结构的多样性,各种生物DNA分子的四种碱基的含量往往不是均等的，碱基的排列也决不是单调的重复，DNA结构的变化方式是无穷无尽的。但DNA两个单链的相对位置上的碱基有严格的配对关系，一条单链的嘌呤的相对位置上必定是嘧啶，嘧啶的相对位置必定是嘌呤。,5、基因水平,基因生物体内一切具有自主复制能力的遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片断原核生物的基因调控,操纵子Operon,结构基因决定某一多肽链结构的DNA模板操纵基因位于结构基因和启动基因之间的一段核苷酸序列启动基因一种依赖于DNA的RNA聚合酶所识别的核苷酸序列,真核生物的基因结构,一般无操纵子结构存在大量不编码序列和重复序列转录和转译在细胞中有空间间隔基因被许多无编码功能的内含子Intron阻隔，使编码序列变成不连续的外显子Extron,基因及其表达产物的规范化表示,基因名称：lacZ基因表达产物：三个大写字母或1个大写2个小写抗性基因：strR,6、密码子水平,遗传密码是指基因DNA链上决定各具体氨基酸的核苷酸的特定排列顺序密码子Codon：遗传密码的信息单位每个密码子由链上三个核苷酸顺序决定，常以mRNA上三个核苷酸顺序来表示三联密码子四个核苷酸有64种组合同一氨基酸由多个密码子编码无义密码子：UAA、UAG、UGA,7、碱基水平（核苷酸水平）,最低突变单位或交换单位DNA链中有A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、（G鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）四种碱基，少数例外5-羟甲基胞嘧啶几个数据每个碱基对的平均分子量6501106的dsDNA约为1.5kb，或0.5m3nmol碱基的重量约为1g多数细菌的基因组在1-9Mb,（二）原核生物的质粒,质粒的定义和特点质粒在基因工程中的应用质粒的分离与鉴定质粒的种类典型的质粒简介,质粒的定义,典型质粒凡是游离于原核生物基因组以外、具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子（cccDNA）质粒的结构麻花状的超螺旋结构1.5-300kb,Mw106-8,相当于约1%核基因组线状质粒：天蓝色链霉菌、赫氏蜱疏螺旋体,微生物质粒DNA与染色体DNA差别,宿主细胞染色体DNA分子量明显大于细胞所含质粒DNA分子量，如大肠杆菌（Escherichiacoli）染色体的DNA分子为4.6103kb左右，而通常用于基因工程中的载体一般均小于10kb，1100106Da。大肠杆菌染色体质粒DNA较宿主细胞染色体DNA更为耐碱性。,微生物质粒DNA与染色体DNA差别,质粒所携带的遗传信息量较少。由于质粒DNA的分子量较小，因此所携带的遗传信息远较宿主细胞染色体所携带的遗传信息为小，而且各携带的遗传信息所控制的细胞生命代谢活动很不相同。一般来说，细胞染色体所携带的遗传信息控制其关系到生死存亡的初级代谢及某些次级代谢，而质粒所携带的遗传信息，一般只与宿主细胞的某些次要特性有关，而并不关系到细胞的生死存亡。,质粒的特点,质粒的功能：非必需的特殊功能接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶和降解环境毒物、基因重组质粒的复制：独立存在于细胞内的复制子松弛型复制控制：质粒复制与核染色体复制不同步，一般只含1-2个质粒严紧型复制控制：质粒复制与核染色体复制同步，一般可含10-15个质粒在不同菌株之间的转移质粒消除：吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子、高温,质粒的特点,可整合性质粒可以与核染色体发生整合与脱离，如F因子，这种质粒称附加体整合：指质粒或温和噬菌体、病毒、转化因子等小型非染色体DNA插入核基因组等大型DNA分子中的现象重组性质粒与质粒之间、质粒与核染色体之间的基因重组,质粒存在的三种形态,细菌质粒和真核生物细胞器DNA的共同点,1、自体复制。2、一旦消失以后，后代细胞中不再出现3、它们的DNA只占染色体DNA的一小部分。,细菌质粒和真核生物细胞器DNA的区别,1、成分和结构简单，一般都是较小的环状DNA分子，并不和其他物质一起构成一些复杂的结构。2、功能更为多样化，可一般不是必需的。3、许多细菌质粒能通过细胞接触而自动地从一个细菌转移到另一个细菌，使两个细菌都带有此质粒。,质粒在基因工程中的应用,质粒用于基因工程操作的优点体积小环状独立复制起始点拷贝数多选择性标记：抗性基因质粒的应用克隆载体：能够完成外源DNA片段复制的DNA分子E.colipBR322质粒及其特点体积小、高拷贝数、易扩增、分离容易、插入较多外源DNA、结构清楚、选择性抗药标记、转化导入宿主细胞,典型克隆载体-E.colipBR322,质粒的分离与鉴定,质粒分离的步骤细胞培养细胞裂解蛋白质和RNA的去除质粒DNA与染色体DNA分离：关键质粒的鉴定电镜琼脂糖凝胶电泳：确定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳密度梯度离心质粒的限制性酶切图谱,质粒的种类,接合性质粒抗药性质粒产细菌素和抗生素质粒特定生理功能质粒产毒质粒,大肠杆菌中的染色体DNA和三种常见质粒DNA的性状比较,典型质粒简介,F质粒R质粒Col质粒Ti质粒Ri质粒Mega质粒降解性质粒,F质粒FPlasmid,F因子、致育因子FertilityFactor、性因子SexFactor，分子量62x106Da，94.5kb。E.coli中决定性别并具有转移能力的质粒E.coliF质粒的遗传图存在F质粒的其他微生物假单胞菌属Pseudomonas嗜血杆菌属Haemophilus奈瑟氏球菌属Neisseria链球菌属Streptococcus,R质粒、RFactor,Resistanceplasmid的发现痢疾志贺氏菌ShigelladysenteriaeE.coli、Klebsiella、Proteus、SalmonellaR质粒的种类与组成RTF质粒（抗性转移因子），它含有调节DNA复制和拷贝数的基因及转移基因，有时还有四环素抗性基因（tet)。分子量为11106Da抗性决定子（r-determinant)，大小不固定，其上含其他抗生素的抗性基因。,R质粒、RFactor,R质粒在细胞中的拷贝数R质粒的应用疾病防治菌种筛选的选择性标记和外源基因的克隆载体,Col（Colicin）质粒,大肠杆菌素质粒、产大肠杆菌素因子Colicingenic细菌素：细菌产生的抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物，是由质粒编码的蛋白质细菌素的种类：大肠杆菌素、枯草杆菌素大肠杆菌素Col质粒的种类Col质粒的应用,Ti质粒,Tumorinducingfactor冠瘿质粒CrownGallPlasmidTi质粒的应用植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体,Ri质粒,RootInducingPlasmidAgrobcteriumrhizogenes侵染双子叶植物的根部，并诱生大量称为毛状根的不定根Ri质粒的应用外源基因的良好载体次生代谢产物的生产,Mega质粒和降解性质粒,Megaplasmid(巨大质粒)存在于根瘤菌属中的其上有一系列与共生固氮相关基因的质粒降解性质粒存在于Pseudomonas，编码一系列复杂降解有机物的酶，如樟脑、辛烷、二甲苯、水杨酸、扁桃酸、萘、甲苯降解性质粒的应用：污水处理与环境保护,可在染色体上不同部位之间移动的遗传物质转座因子等,转座因子包括插入序列（insertionsequences，IS）、转座子（transposons，TN）和某些病毒如Mu噬菌体。这在真核微生物和原核微生物中都有存在。（1）插入序列IS能在染色体上和质粒的许多位点上插入并改换位点，因此也称跳跃基因（jumpinggenes）。（2）转座子是能够插入染色体或质粒不同位点的一般DNA序列，大小为几个kb，具有转座功能，即可移动至不同位点上去，本身也可复制。转座后在原来位置仍保留1份拷贝。转座子两末端的DNA碱基序列为反向重复序列。转座子上携带有编码某些细菌表型特征的基因，如抗卡那霉素和新霉素的基因，且本身也可自我复制。另外，侵染微生物的某些DNA病毒、RNA病毒和噬菌体能自我复制，也可整合到染色体或质粒上，且可在微生物细胞之间进行转移而可看作为一类微生物染色体外的遗传物质。,RNA作为遗传物质,某些动植物病毒和微生物噬菌体是以RNA为遗传物质的。动物骨髓灰质炎病毒为单链RNA，锡兰豇豆花叶病毒为单链RNA，动物呼肠3型病毒为双链RNA，噬菌体MS2为单链RNA，6为双链RNA。这些病毒和噬菌体中没有DNA。单链RNA噬菌体MS2很小，仅26nm长，二十面体，每个病毒颗粒有180个壳体蛋白。RNA有3569个核苷酸长，组成的基因可直接感染大肠杆菌。其RNA链可直接作为mRNA起作用。编码成熟蛋白（maturationprotein）、壳体蛋白（coatprotein）、裂解蛋白（lysisprotein）和RNA复制酶（RNAreplicase）。,关于朊病毒的遗传物质问题,朊病毒（Virino）是一种比病毒更小、仅含具有侵染性的疏水蛋白质分子，是一类能引起哺乳动物的亚急性海绵样脑病的病原因子。纯化的感染因子称为朊病毒蛋白（PrP）。在正常的人和动物细胞的DNA中都有编码PrP的基因。且无论受感染与否，宿主细胞中PrPmRNA水平保持稳定，即PrP是细胞组成型基因的表达产物，为一种膜糖蛋白，称为PrPc。PrPc与引发羊瘙痒病的PrPsc是同分异构体，一级结构相同，但折叠程度不同，PrPsc的折叠程度大为增加而导致溶解度降低，对蛋白酶的抗性增强。,关于朊病毒的遗传物质问题,有人认为PrPsc进入细胞后与PrPc的结合，形成PrPc-PrPsc复合体，使PrPc构型变化为PrPsc，即形成2个PrPsc分子，2个PrPsc分子再分别与2个PrPc分子结合，进入下一轮循环，PrPsc可呈指数增加。尽管至今仍有人认为朊病毒含有很少量的核酸物质，但尚无确切证据表明PrPsc的增殖是由核酸控制的。,PrPC与PrPSC的转换,人的库鲁病(kuru)、克雅氏病(CreutzfeldtJakobdisease,CJD)等,羊搔痒症(scrapie),牛海绵状脑病(spongiformencephalopathy),第二节基因突变和诱变育种,进化的源泉,基因突变和诱变育种,一、基因突变,什么是基因突变（突变）？变异的一类，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质（DNA或RNA）的分子结构或数量突然发生的稳定的可遗传的变化，可自发或诱导产生。狭义突变：基因突变（点突变）广义突变：基因突变和染色体畸变突变率：一般很低10-610-9野生型菌株Wildtypestrain从自然界中分离得到的菌株突变株Mutant野生型菌株经突变以后形成的带有新性状的菌株,基因突变,突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生退化的主要原因。自然界形形色色的菌种是生物长期进化，即通过变异和自然选择的结果。除可能遗传的变异外，还有一种变化是不遗传的，因为微生物只限当代表现，而不遗传给下一代，即不遗传，这种变化不能成为变异。在本质上发生了的变化才叫变异。,基因突变又称点突变，DNA链上的一对突变或少数几对碱基发生改变。(碱基置换、移码突变)染色体畸变DNA的大段变化(损伤)现象(添加、缺失、易位、倒位)基因重组：把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组(原核生物、真核生物),遗传性变异,遗传变异类别,基因突变类型,选择性基因突变凡是能用选择性培养基（选择性条件）快速选择出来的突变株选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型非选择性基因突变形态突变型抗原突变型产量突变型,1、营养缺陷型Auxotroph,某野生型菌株由于发生基因突变引起某酶合成能力丧失，从而丧失合成一种或几种生长因子能力的突变型，无法再在基本培养基（MM）上正常生长繁殖，须在加入相应生长因子的基本培养基上才能正常生长的变异类型营养缺陷型突变菌株的应用遗传学分子生物学遗传工程微生物育种,2、抗性突变型ResistantMutant,指野生型菌株由于发生基因突变而产生了对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型化学药物或致死物理因子抗生素、紫外线抗性突变型突变菌株的应用遗传学分子生物学遗传工程微生物育种,3、条件致死突变型,ConditionalIethalmutant某菌株或病毒经基因突变后，在某条件下可正常生长、繁殖，表现其正常的表型，在另一条件下无法生长、繁殖的突变类型。实例：温度敏感突变株Tempetaturesensitivemutant,TsMutantE.coli：37下正常生长、42下不能生长T4噬菌体：25下具有感染力,37无感染力你认为导致Ts突变的原因是什么？蛋白质的结构与功能,4、形态突变型,MorphologicalMutant由于突变引起个体或菌落形态的非选择性变异实例：微生物的菌落和个体形态包括哪些？芽孢、鞭毛、荚膜、菌落大小粗糙光滑、颜色、霉菌放线菌孢子及颜色、噬菌斑胆小清晰度,5、抗原突变型,基因突变引起抗原结构（细胞或细胞表面成分）发生变异的突变型，一般属于非选择性突变实例细胞壁缺陷变异：L型细菌荚膜成分变异鞭毛成分变异,6、产量突变型,通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株高产突变型正变株低产突变型负变株如何筛选高产正变株?,（二）突变率,每一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率亦可用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。常为10-610-9一般突变是独立发生的。突变的基因不会影响其他基因的突变率。双重突变的概率是各个突变概率的乘积如何测定某基因的突变率？如何筛选突变株？回复突变株抗药性突变株,基因的突变率,一般基因的自发突变率：10-6转座突变率：10-4无义突变率或错义突变率：10-8E.coli乳糖发酵性状的突变率：10-10,一些菌种某些性状的自发突变率,（三）突变的特点,不对应性突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系自发性：可自发的发生突变稀有性突变几率很低而且较稳定（10-610-9）独立性某种基因的突变率不受其他基因突变率的影响可诱变性诱变剂Mutagen提高自发突变的几率（10105），而自发突变与诱变间无本质上的差异,突变的特点,稳定性突变本质是遗传物质结构发生稳定的变化，所产生的新性状也是稳定的、可遗传的可逆性性状的正向突变和回复突变都可发生，几率相同正向突变ForwardMutant野生型基因变异为突变型基因的过程回复突变Reverse/BackMutant由突变型向野生型表型的转变,（四）基因突变的自发性与不对应性证明,两种观点的碰撞突变是生物对某特定环境（化学药物、抗生素和高温）的适应，环境是突变的诱因抗性突变是自发产生的，即使是诱发突变，所产生的性状与诱发因素也是不对应的证明试验1、变量试验2、Newcombe涂布试验3、Lederberg等的影印平板培养法,（四）基因突变的自发性与不对应性证明,1、变量试验变量试验又称波动试验或彷徨试验。1943年，S.E.Luria和M.Delbrck根据统计学原理，设计了的实验。T1sensitiveE.coliT1resistantE.coli方法学敏感菌株不能形成菌落平板涂布技术,彷徨试验(fluctuationtest),2、涂布试验,试验原理变量试验相同，方法更为简便，且可计算突变率。固体涂布平板法敏感菌株不能形成菌落突变率的计算,实验二Newcombe的涂布试验,初始接种量：5104个/皿培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌这时，每个平皿上的细胞数为：510051042.6108个/皿在6个平板上，比接种时增加的细胞数为：6（2.61085104）=15.6108在未涂布的平板上共发现28个突变，故突变率=28/15.6108=1.8108,3、影印平板培养试验,ReplicaPlating1952年，J.Lederberg夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变株的间接选择，更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应药物环境毫不相干。试验原理抗药性突变链霉素敏感的E.coliK12菌株,影印平板法,影印培养法,使在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种方法。它是从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株的方法过程把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木圆柱（直径略小于培养皿）上，使其上沾满来自培养皿平板上的菌落，然后把这一“印章”上的细菌一一接种到不同的选择培养基平板上，待培养基后，对各皿相同位置上的菌落作对比，就可选出适当的突变型菌株平板影印培养法证明E.coliK12自发抗链霉素突变株,在根本未接触过任何一点链霉素的情况下，就可以筛选到大量抗链霉素的突变株，充分说明了突变是自发产生的，链霉素只是起到了一种检出作用。平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用，而且在育种实践和其它研究中均有应用。,影印培养法,（五）基因突变的机制,1、诱发突变,诱变（InducedMutation）利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段诱变剂（Mutagen）：凡能提高突变率的任何因素碱基置换（Substitution)移码突变（Frame-shiftMutation)染色体畸变(Chromosomalaberration),碱基置换,染色体的微小损伤一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的点突变,碱基对的置换可分成两个亚类：一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换，称为转换；另一类是DNA链上的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换，称为颠换A：TT：AATC：GG：CCG双链DNA单链DNA（实线代表转换，虚线代表颠换）,(1)错义突变一种氨基酸，变成另一种氨基酸；(2)无义突变氨基酸的碱基置换后变成UAG（琥珀突变）UAA（赫石突变）UGA（乳石突变）等终止密码子；,碱基置换后会出现下列几种情况,碱基置换后会出现下列几种情况,(3)同义突变，碱基发生了置换，但由于遗传密码子的简并性，氨基酸不变。如密码子GCU置换成GCC后，它们都是丙氨酸的密码子；(4)沉默突变，碱基置换造成多肽链中一个氨基酸的改变，但该氨基酸对蛋白质的结构和功能没有多大的影响，并没引起细胞表型变化。,导致置换的诱变剂,导致置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂亚硝酸、亚硝基胍、硫酸二乙酯等直接与核酸发生化学反应间接引起置换的诱变剂：碱基类似物5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、6-氯嘌呤等碱基类似物作用：通过活细胞代谢活动掺入到DNA分子中,直接引起置换的诱变剂,亚硝酸是一种对含有氨基的碱基对直接作用而诱发碱基对转换的诱变剂。它能使碱基中的氨基氧化脱氨，从而使腺嘌呤（A）变成次黄膘呤（H），胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U）;而后由于H和C配对，U与A配对，因此当DNA再次复制时，A:T就转换为G:C，而G:C就转换为A:T。,H:CH:C-G:CH:CG:CA:TH:T-A:T亚硝酸类引起的碱基对置换,烷化剂是诱变育种极其重要的一类诱变剂，它们的化学结构都带有一个或多个活性烷基。所有这些物质通过烷化磷酸基形成烷化嘌呤和烷化嘧啶与DNA作用，特别是经常形成烷化鸟嘌呤。烷化作用导致基因突变的机制尚未定论。碱基类似物作用，引起碱基配对的错误。烷基在鸟嘌呤引起脱嘌呤作用，使鸟嘌呤从DNA链上脱落下来，进而引起DNA复制时碱基对的缺失和置换。,腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He）He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）DNA复制时，HK与胞嘧啶（C）配对DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现了转换。,由亚硝酸引起的ATGC的转换,羟胺（HA）,能专一地与胞嘧啶作用。修饰后的N-4-羟基胞嘧啶只能与腺嘌呤配对，引起C：GT：A碱基转换，羟胺引起的转换是单向的，即无法引起T：AC：G的碱基转换。,羟胺引起CGTA的机制,间接引起置换的诱变剂,作用机制是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后，引起碱基对的置换，因此是间接的。在这些碱基类似物中，最常被应用的是5-溴尿嘧啶（5-BrU）和-氨基嘌呤（-AP）。5-BrU是T的代谢类似物。5-BrU以酮式状态时可以替代T与A配对；5-BrU以烯醇式状态时替代C与G配对；5BrU可以通过烯醇式和酮式结构的变化；引起碱基对置换。,5-BU在DNA复制时掺入并引起碱基转换（BUk为酮式5-BU；BUe为烯醇式5-BU）,碱基置换引起的密码子突变和对多肽链合成的影响,由碱基置换引起的三种突变类型无义突变错义突变同义突变,移码突变,诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（缺失），从而使该部位后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变，移码突变株属于DNA分子的微小损伤，一种点突变，结果只涉及有关基因突变点之后的遗传密码阅读框架发生错误，并不影响基因突变点之后其他基因的正常读码。导致移码突变诱变剂：吖啶类染料（吖啶黄，吖啶橙，原黄素，氨基吖啶，ICR(InstituteofCancerResearch)类化合物,A-野生型B-由CG对的插入所造成的移码突变C-由AT对的缺失所造成的移码突变,移码突变的图示,吖啶类化合物引起移码突变机理,平面型三环分子，结构类似嘌呤和嘧啶可以嵌入相邻的两个碱基之间，造成DNA双链双螺旋部分解开（两个碱基对之间为0.34nm，嵌入一个吖啶分子后成为0.68nm，使DNA在复制过程中，使链上增添或缺失一个碱基）结果引起移码突变吖啶类化合物可以引起移码突变及其回复突变,染色体畸变,诱变剂（某些强烈理化因子如电离辐射X射线、烷化基、亚硝酸）除了引起点突变之外，还能引起染色体DNA分子的大损伤，即染色体结构的改变缺失(Deletion)重复(Duplication)插入(Insertion)易位(Translocation)倒位(Inversion)染色体数目变化,染色体畸变1-缺失2-重复3-倒位4-相互易位,引起染色体畸变的诱变剂,引起染色体畸变的诱变剂射线：紫外线UV，安全方便成本低，注意修复亚硝酸、烷化剂,染色体的易位，转座与转座因子,DiscoveredbyB.McClintockin1940sTranspositionDNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象Transposableelement(TE)具有转座作用的一段DNA序列，可移动基因/遗传因子，跳跃基因插入序列转座子转座噬菌体（Mu噬菌体）,转座因子的特点和转座的过程,转座因子的特点非同源重组方式的DNA转移一定长度的末端重复序列转座酶基因（TransposaseGene）转座的过程P211,转座因子的插入引起受体DNA上靶序列的复制,三类转座因子及其特点的比较,自发突变(SpontaneousMutant),没有人工干预条件下生物体自然发生的低频率突变自发突变的诱导因素背景辐射和环境因素：多因素低剂量的诱变效应微生物自身有害代谢产物的诱变效应：过氧化氢DNA复制过程碱基配对错误碱基错配频率10-7-10-11/次复制，每个基因1000bp，自发突变频率为10-6，菌体浓度108CFU/ml互变异构效应环出效应,（1）细胞外的诱发因素,自然环境或人工条件下的物理和化学因素自然环境中，宇宙间的短波辐射、宇宙线和紫外线等，多因素低剂量长期辐射的综合效应，将会引起生物的自发突变。自然环境中存在低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料等都能成为引起生物突变的化学因素,（2）细胞内的诱发因素,细胞的代谢活动会产生一些诱变物质，如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等，它们是引起自发突变的内源诱变剂。许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能就是这类原因。,（3）DNA分子内部因素,DNA分子中的碱基存在着互变异构效应。A、T、G、C四种碱基，存在酮基结构（T，G）或氨基结构（A，C），酮式与烯醇式存在互变异构，氨基式与亚氨基式存在互变状态一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式,（3）DNA分子内部因素,DNA两条互补链之间总是以A:T和C:G碱基配对。但T偶尔也会以稀有的烯醇式形式出现，这样在DNA复制到达这一位置的瞬间，新合成链中T对应的不再是A，而是G；同理，若碱基C以稀有的亚氨基形式出现，在DNA复制到达这一位置的瞬间，则它对应的不是G据统计，碱基对发生自发突变的几率约为108109。,环出效应,环状突出效应。有人提出，在DNA的复制过程中，如果其中某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失,自发突变的机制,1.背景辐射和环境因素，如宇宙间的短波辐射、紫外线以及高温、病毒等。2.转座因子的作用。DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体的某一部位转移到同一染色体上另一部位或其它染色体上某一部位的现象，称为转座。转座是由一段特殊的DNA序列引起的，这种具有转座作用的DNA序列叫转座因子，也称可移动基因、可移动遗传因子或跳跃基因。转座作用会使某一段DNA分子在染色体上发生位置变化，由此可引发突变。,3.微生物自身代谢过程产生的一些具有诱变作用的物质，如过氧化氢、咖啡碱、硫氰化物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸等。作用于DNA分子，由此引发突变的产生。4、DNA复制过程中的碱基错误配对，在DNA分子的复制过程中，每个碱基对配对错误的发生频率为10-710-11。一个基因的平均长度约1000bp，所以，由于碱基配对错误引起的自发突变率为10-410-8。,自发突变的机制,（六）紫外线对DNA损伤及修复,UltravioletRay作用机理紫外线使同链DNA上形成胸腺嘧啶二聚体，减弱双链间氢键的作用，引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基的正常配对，引起突变或死亡嘧啶比嘌呤敏感得多，形成嘧啶二聚体TT、TC、CC,紫外线,紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光非电离辐射的射线，波长范围为136390纳米。但诱变有效范围是200300纳米，其中又以260纳米左右效果最好。之所以具有诱变作用，主要是紫外线的作用光谱与核酸的吸收光谱相一致，所以DNA最容易受紫外线的影响。各种微生物对紫外线的敏感性并不相同，有的差异很大，可以相差几千倍，甚至上万倍。一般诱变用15瓦低功率的紫外灯，这时灯光的光谱比较集中于2537埃，是比较有效的诱变作用光谱。,紫外辐射引起的DNA的结构的变化,DNA损伤的修复,光复活作用光裂合酶在可见光下使二聚体重新分解成单体光复活是一种酶促反应，参与的酶叫光裂合酶或光复活酶，分子量为5.56.5104d，存在于多种微生物细胞内。该酶在黑暗环境下没有活性，但可吸收300500nm波长的可见光的能量而被激活。暗修复作用在暗处即可修复损伤的DNA，须核酸内切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶,光复活作用,Photoreactivation,Photorestoration将经过UV照射的微生物立即暴露于可见光下所出现的降低其死亡率的现象StreptomycesgriseusE.coli光复活的机理光解酶，光裂合酶Photolyase带有嘧啶二聚体的DNA分子在黑暗下与一种光激活酶结合，在300-500nm可见光下获得光能而激活，使嘧啶二聚体重新分解为单体Monomer,Question？,问题紫外线诱变育种时，应该在红光下进行照射和后续操作，并在黑暗条件下培养？,紫外线照射的操作方法,在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最好装有稳压装置，以求剂量稳定。处理时，可将5毫升菌悬液放在直径5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上，使培养皿底部离灯管30厘米左右，培养皿底要放平，处理前应先开灯2030分钟预热稳定。照射时启动磁力搅拌器，以求照射均匀。一般微生物营养细胞在上述条件下照射几十秒到数分钟即可死亡，芽孢杆菌10分钟左右也可死亡，革兰氏阳性菌和无芽孢菌对紫外线比较敏感。为了避免光复活作用，应在红光下操作，处理后的菌悬液若需进行增殖培养，也可用黑布包起来进行避光培养。,切除修复(ExecisionRerpair),活细胞内对被UV等诱变剂损伤后DNA的一种修复方式，也称暗修复一种不依赖可见光，指通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式需要四种酶参与内切核酸酶外切核酸酶DNA聚合酶DNA连接酶过程,含胸腺嘧啶二聚体的UV损伤DNA的切除修复,其他修复类型,重组修复SOS修复,二、突变与育种Breeding,自发突变与育种诱变育种,自发突变的机制,1.背景辐射和环境因素，如宇宙间的短波辐射、紫外线以及高温、病毒等。2.转座因子的作用。DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体的某一部位转移到同一染色体上另一部位或其它染色体上某一部位的现象，称为转座。转座是由一段特殊的DNA序列引起的，这种具有转座作用的DNA序列叫转座因子，也称可移动基因、可移动遗传因子或跳跃基因。转座作用会使某一段DNA分子在染色体上发生位置变化，由此可引发突变。,自发突变的机制,3.微生物自身代谢过程产生的一些具有诱变作用的物质，如过氧化氢、咖啡碱、硫氰化物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸等。作用于DNA分子，由此引发突变的产生。4、DNA复制过程中的碱基错误配对，在DNA分子的复制过程中，每个碱基对配对错误的发生频率为10-710-11。一个基因的平均长度约1000bp，所以，由于碱基配对错误引起的自发突变率为10-410-8。,自发突变与育种,从生产中选育生产中菌自发突变及时选育出所需性状的菌正突变株PlusMutant定向培育优良品种用某特定环境长期处理某微生物群体，同时不断对其移种传代，以达到累计并选择合适的自发突变体的育种方法定向培育获得卡介苗牛型结核杆菌牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上移种230多代显著减毒结核杆菌（卡介苗）,从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,诱变育种,BreedingbyInducedMutation理化诱变剂处理均匀、分散的微生物群体提高突变率巧妙筛选诱变：随机的过程筛选：定向的过程诱变育种的实践意义工业与实验室：代谢产物的高产突变株生产角度：提高代谢产物的产量，减少杂质，扩大品种，改进产品质量，简化生产工艺方法：简便易行，工作速度快，收效显著,诱变育种的基本过程,选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,1、诱变育种的基本环节,以选育高产突变株为例,诱变育种的步骤,1.出发菌株纯化，同步培养2.培养液离心收集细胞、洗涤，制菌悬液，玻璃株打散，过滤3.单个细胞或孢子悬液活菌计数，诱变预备试验4.诱变剂处理存活细胞计数，计算致死率5.平板分离变异率计算6.挑变异菌于斜面培养基上7.初筛性能粗测8.复筛性能精测9.菌种保藏及扩大试验10.菌种用于生产，同时进行保藏,2、诱变育种中的几个原则,出发菌株优良选择简便有效的诱变剂选择单细胞或单孢子悬液最适诱变剂量的选择充分利用复合处理的协同效应利用和创造形态、生理与产量间的相关指标设计高效的筛选方案创造新型的筛选方法,出发菌株优良,OriginalStrain选择以自然变异菌株或具有有利性状的出发菌株，有利于提高育种效率生产中的自发突变菌株。这类菌株的特点是对诱变因素敏感，容易发生变异，而且容易向好的方向变异，即产生正突变。选用具有有利于进一步研究或应用性状的菌株生长速度快、营养要求低选用已经发生过其他突变的菌株选育对诱变剂敏感的增变变异菌株,一般的看法是原来是高产型的菌株，经过再诱变，容易产生负突变，获得高产突变株的难度较大。相比之下，产量较低的野生型菌株容易提高产量，所以有人认为产量最高的菌株不一定是继续提高产量潜力最高的菌株。,诱变菌株的培养,若出发菌株是细菌或酵母菌等单细胞微生物，一般采用营养细胞进行诱变处理。处理前，细胞应进行前培养，处于最旺盛的对数期，群体应尽可能达到同步生长状态，细胞内应具有丰富的内源性碱基，这样诱变剂对群体中各细胞的处理均一，DNA被诱变剂作用后所造成的损伤能快速通过复制而形成突变，可以获得较高的突变率。由于培养在不同培养基内的细胞，在相同照射剂量下，存活率是相同的。因此，提高变异率是由于前培养在碱基成分丰富的培养基中，为细胞在诱变后复制变异了的遗传物质提供了条件。,对于丝状菌，一般取其孢子进行处理，因为多数丝状菌的孢子是单核，经诱变处理后不易发生分离现象。但孢子的处于休眠状态，所以诱变效果不如营养细胞好。可将孢子培养至刚刚萌发，使其处于生理活性高的同步生长状态。对于某些不产孢子的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。,前培养,要求菌体处于对数生长期，细胞分散且为单细胞，方法：玻璃珠打散10-15min;加.3%吐温80用无菌脱脂棉过滤。制备：物理诱变剂生理盐水化学诱变剂缓冲液浓度：细菌、放线菌108个/ml霉菌、酵母菌106个/ml,制备单细胞或单孢子悬液,诱变菌悬液的制备,第一，选择合适的介质。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲液制备，当用化学因素处理时，要使用缓冲液，因很多化学诱变剂需要在一定的pH环境中才能发挥作用，而且在处过程中pH值也会变动。第二，使细胞或孢子要处于良好的分散状态。使细胞分散均匀的方法是先用玻璃珠振荡分散，然后在用脱脂棉或过滤纸过滤