菌种与种子扩大培养

第一章菌种与种子扩大培养,决定发酵工业生产水平三要素：生产菌种性能；发酵过程的工艺及设备；产物提取过程的工艺及设备,菌种来源,诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证；,从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物约为自然界总数的1-5%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；,基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开发的进程。,一、工业微生物,分离思路新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。,从自然界中分离菌种的一般过程,新种分离与筛选的步骤,定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,采样,1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤（如一些野果生长区和果园内）和沼泽地中，酵母和霉菌较多；采样的对象也可以是植物或动植物残体，腐败物品，霉菌较多；某些水域厌氧菌含量较多。,2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。,增殖培养,就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,纯种分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,性能测定,这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株。,工业生产常用菌种,细菌(Bacteria)放线菌(Actinomycetes)单细胞真菌-酵母(Yeast)多细胞真菌-霉菌(Molds),1细菌(Bacteria),形状和大小：单细胞微生物；有球型、杆型和螺旋型；典型直径0.51微米，长度10微米；繁殖方式：裂殖，倍增时间2545分钟。工业上重要的细菌：G+：枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、北京棒杆菌等。G-：醋酸杆菌、大肠杆菌。产品：淀粉酶制剂，乳酸，乙酸，氨基酸等,2放线菌(Actinomycetes),形状和大小：细胞呈长丝状，菌落呈放线状，介于细菌和真菌之间，菌丝直径0.21.2微米，与杆菌接近；生长和繁殖：低等的(如诺卡氏菌)通过菌丝断裂繁殖；高等的(如链霉菌)在孢子丝成熟后分化成许多孢子，孢子在适宜的环境中吸收水分，膨胀、萌发，成为新的放线菌。,2放线菌(Actinomycetes),工业上重要的放线菌龟裂链霉菌（土霉素）金黄色链霉菌（金霉素）灰色链霉素（链霉素）红链霉菌（红霉素）红小单胞菌（庆大霉素）委内瑞拉链霉菌（氯霉素）卡那链霉菌（卡那霉素）,3单细胞真菌-酵母(Yeast),形状和大小：单细胞，卵圆形，圆形或圆柱形；比细菌大，直径约15微米，长约530微米。生长与繁殖：酵母分有性和无性繁殖，以无性繁殖为主。无性繁殖分为芽殖和裂殖，以芽殖为主。,工业上重要的酵母菌啤酒酵母(酒精、啤酒等)假丝酵母(单细胞蛋白、柠檬酸、脂肪酸、石油脱蜡)。,4多细胞真菌-霉菌(Molds),形状和大小：分支状，菌丝体盘结交错，形成浓密菌落，使发酵液粘稠。比放线菌大，直径310m生长与繁殖：片段菌丝可以生长成新的菌丝体；有性和无性方式，产生孢子进行繁殖；无性繁殖是主要方式，生长中，菌丝伸长和分支，从菌丝体顶端形成新的孢子，继而形成细胞。新细胞具有菌龄，典型的倍增时间为48小时；,4多细胞真菌-霉菌(Molds),工业上重要的霉菌曲霉属:黑曲霉淀粉酶、蛋白酶、柠檬酸和葡萄糖酸米曲霉酱油青霉属:产黄青霉青霉素展开青霉灰黄霉素根霉属:米根霉制曲、乳酸,一些常用工业微生物,抗生素生产有关的微生物,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,氨基酸生产有关的微生物,食品工业微生物,包括：酿造业，酶制剂等食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,诱变育种,以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-610-10左右。诱变育种：利用各种物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。诱发突变的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。,诱变剂,物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子；生物诱变剂：噬菌体、转座子化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂等。,诱变育种步骤,出发菌株的选择菌悬液的制备前培养诱变处理变异菌株的分离和筛选,紫外线的诱变育种,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。,例,被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106107个ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.51.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,操作步骤1将细菌培养液以3000rmin离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。2将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达107-108个ml左右，作为待处理菌悬液。3取24m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。,4取未照射的制备菌液和照射菌液各0.1ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120rmin振荡培养46h。6取中间培养液稀释分离、培养。7挑取菌落进行检测。,基因的直接进化育种,突变基因突变库的建立筛选基因突变库的筛选基因复制与遗传,步骤：,在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物,有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强,遗传性能要相对稳定,不易感染它种微生物或噬菌体,不是病原菌，产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）,生产特性要符合工艺要求，培养条件易于控制，生长迅速、发酵周期短,工业微生物的要求,防止菌种衰退,衰退的表现：所需产物的生产能力下降，营养物质代谢和生长繁殖能力下降，发酵周期延长，抗不良环境条件的性能减弱等衰退的原因：内因：基因突变，变异菌株性状分离外因：菌种保藏不妥；菌种的生长条件要求没有得到满足；或遇到不利的条件，或失去某些需要的条件等；菌种的连续传代是菌种退化的主要原因防止衰退的方法：合理培养条件，减少传代次数复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始个体,工业微生物菌种保藏技术,(1)低温冷冻保藏；(2)转接培养或斜面传代保藏；(3)矿物油保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。保藏原则：选择优良纯种、创造休眠环境保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。,冷冻保藏：-20以下冷冻，使微生物代谢活动停止分类：普通冷冻保藏(-20)超低温冷冻保藏(-60一-80)液氮冷冻保藏(-156)特点：简单有效培养物运输较困难,在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。,冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。特点：冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力冻干后的菌株可常温保存，便于运输必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等,传代保藏：斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存，供试验用矿物油保藏：将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别用于难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌载体保藏：麦壳，砂土灭菌后可用作载体,几种常用菌种保藏方法的比较,种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。,二、种子扩大培养,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，保持稳定的生产能力,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,二，种子制备的过程：实验室种子制备阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。生产车间种子制备阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发酵车间管理，因此称这些培养过程为生产车间阶段。,实验室种子的制备对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。试管三角瓶摇床种子罐,生产车间种子制备,实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养种子罐培养一方面使菌种获得足够的数量，另一方面种子罐中的培养基更接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，譬如通无菌空气，搅拌形式等等，以使菌体适应发酵环境,（1）表面培养,表面培养是一种好氧静置培养方法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固态表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液/气固界面向培养基内传递。这种培养方法菌的生长速度与培养基深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度也越快。氧的供给常成为发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。如醋酸、柠檬酸发酵和曲盘制曲。,种子培养的方法,固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。,（2）固体培养,固体培养具有以下优点：原料：以谷物和农业废物为主要原料，只需外加适量水分、无机盐等。培养基组成简单。防止污染：利用霉菌能在水分较低的基质表面进行增殖的特性，在这种条件下，细菌生长不好，因此不易引起细菌污染。通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要，灵活加以调节。在固体培养中，氧气是由基质粒子间空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的用通气搅拌供给氧气节能。,（3）液体深层培养,用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。,（4）载体培养法,载体培养脱胎于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是近年来新发展的一种培养方法。特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。载体的取材必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。,影响种子质量的因素及控制,1，种子质量的判断种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。在培养过程中定期取样测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正常。1）pH；2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量；3）菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）；4）其他参数，如接前抗生素含量、某种酶活力等5）无任何杂菌污染,2，影响种子质量的主要因素（1）培养基主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。（2）培养条件温度：温度直接影响生长和酶的合成；pH值：对微生物有明显的影响。通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用）泡沫(危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率)（3）染菌的控制染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯；（4）种龄及接种量,种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。,接种龄与接种量,接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，,接种龄与接种量,移种：防止染菌孢子悬浮液种子、摇瓶菌丝体种子采用火罐法或压差法接入。种子罐之间或发酵罐间的移种方式，主要采用差压法。由种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降至零，否则会引起染菌。,从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种,从种子罐接种,种子罐级数的确定,孢子或摇瓶菌丝,一级种子罐,二级发酵发酵罐,二级种子罐,三级发酵发酵罐,四级发酵发酵罐,三级种子罐,种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数：1、接种量2、孢子发芽能力、菌体生长特性3、发酵规模级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级,种子进入发酵罐：能迅速生长，达到一定的量，利于产物合成。,3、种子异常分析,A、菌种生长发育缓慢或过快：通入的空气温度低、灭菌质量差B、菌丝结团：接种量、搅拌不好。C、菌丝粘壁：搅拌不好、泡沫多、装料少。,种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,1