生物大分子的色谱分离和纯化

复习,浓差极化浓差极化是指在超滤过程中，由于水透过膜，因而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓度梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用.,复习,膜的污染膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物(附生)污垢所引起的。,复习,防止膜污染的方法（1）预处理法调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生物性劣质等。（2）开发抗污染的膜（3）加大供给液的流速,第七章生物大分子的色谱分离与纯化,第一节色谱概论一、色谱的概念色谱（层析）是一个建立在吸附、分配、离子交换、亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色层分离。二、色谱的特点能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分离并检测出来。它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中（其中静止的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经过连续多次在两相中的质量交换，从而使不同组分得以分离，这就是色谱法所依据的基本原理。,必要条件,充分条件,2.色谱具有高效、快速和灵敏的特点,色谱分离图示,根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起溶质移动速度的不同而进行分离的方法。互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。,色谱分离图示,三、层析的分类,根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,凝胶过滤法,分配层析法,离子交换色层分离法,吸附层析法,疏水作用色层分离法,金属螯合色层分离法,共价作用色层分离法,根据实验技术的分类,低压层析技术,中压层析技术,高压层析技术,电泳法,操作压力在0.5MPa-5MPa之间,操作压力在5Mpa-40MPa之间,操作压力小于0.5MPa,靠溶质分子在电场中的移动速度不同而分离,根据固定相的形状不同的分类：,柱层析法,纸层析法,薄层层析法,根据流动相的物态不同的分类,汽相层析法,液相层析法,操作方式不同的分类,迎头法,顶替法,洗脱分析法,层析分类,吸附色谱与其它色谱法的异同点,三、色谱的分类,1.5层析剂种类,氧化铝硅胶活性炭琼脂糖纤维素,现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。选择的原则：易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交换色谱；样品既溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。,为何选择色谱作为生物分子纯化方法？,不产生热不产生外力高回收率高分辨率线性放大，可预期可自动化大量成功例子,PrinciplesofOperationforChromatographyTechniques,GelFiltration,IonExchange,HydrophobicInteraction,Affinity,ReversedPhase,1.色谱分离种类,第七章生物大分子的色谱分离与纯化,2.分离对象:酶、多糖蛋白质核酸等.3.分离类型:分析色谱(10mg)中等规模制备色谱(10-50mg)制备色谱(0.1-1g)工业生产规模色谱(20g/d),Chromatography,国产气相色谱仪,HP高压液相色谱仪,美国气相色谱仪,4.分离设备,4.分离设备,4.分离设备,制备色谱技术,生产规模制备色谱柱直径100-800mm,中试规模制备色谱柱直径50-150mm,小量制备，色谱柱直径10-40mm,4.分离设备,制备液相色谱系列,半制备液相色谱,中试规模制备色谱,工业规模制备色谱,制备液相色谱,分析液相色谱,5.色谱法的分类按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)根据固定相的物态：气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法按使用的形式分类(1)柱色谱、(2)纸色谱、(3)薄层色谱,按分离机理分类(1)吸附色谱、(2)分配色谱、(3)离子交换色谱、(4)凝胶色谱,6.色谱法的特点(1)高选择性(2)高效能(3)高灵敏度可以分析质量分数为10-610-9数量级、检出限量低至10-1lg的物质，适于微量和痕量分析。,7.色谱法的应用(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；(2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。,(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。(4)色谱质谱联用仪已成为研究生物大分子结构的重要手段。,第一节基本理论,一计量置换保留理论分析色谱与制备色谱:分析色谱灵敏度进样量毛细管柱色谱制备色谱分离与纯化较多的产品增加进样量,(2)溶质计量置换吸附理论:当一个溶质被吸附剂吸附时，在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目的溶剂分子。用计量置换这一概念和相同的热力学平衡，将多年来物理化学家和色谱学家各自独立进行研究的液-固吸附机理及溶质在液相色谱中的保留机理统一起来。,第一节基本理论,二有效柱长和最短柱长在实际应用中，一般认为色谱柱的长径比为10，是色谱柱较为合适的几何比例。对于生物大分子而言，它的保留主要是由流动相中置换剂的浓度决定的，柱长对生物大分子的分离几乎没有影响，有时会出现短柱较长柱的分离效果还好的情况。,二有效柱长和最短柱长,不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的线速度时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献，此时溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献；而当不同溶质在其迁移速度等于流动相的线速度时，溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。,二有效柱长和最短柱长有效柱长（Leff）：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。最短柱长(Lmin)：混合溶质中使一对最难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时所需的最短距离。,分离度,第二节装置和操作技术,装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和检测器4大部分。,1.柱色谱系统的组成,色谱介质有各种各样，但柱式色谱系统的组成基本相似，一般由蠕动泵、色谱柱、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成。,柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成：A蠕动泵B层析柱C装柱D加试样E洗脱F检测器G部分收集器,柱层析系统的组成,柱层析装置图,2纸层析法,2.1基本原理2.2操作方法2.3操作步骤,小实验,当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。看看接下来会发生什么事情,可以看出1号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。而4号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。,1,2,3,4,这就是纸层析法。对照上图，可知道1-4号的各代表什么氨基酸。纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。,1,2,3,4,甘氨酸,半胱氨酸,组氨酸,缬氨酸,纸层析小实验动画演示,凝胶装置图,色谱峰和分离结果,第二节装置和操作技术,柱层析法的一般技术,1层析柱层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。层析柱的基本装置如图。,2层析材料的准备许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。,在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。,3装柱层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至13体积，并使支持板下的“死体积”不存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层。最好一次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。,4加样上柱前，先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，保持一定高度的液面。,4）上样样品浓度越高越好；上样体积越小，分辨率越高；上样体积一般为床体积的15%；例外：G-25脱盐30%亲和层析为床体积的几倍,5洗脱用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。3）洗脱影响分离效果的主要因素之一：洗脱流速。要求流速合适而恒定。,洗脱方式连续洗脱（continualelution）：同一种洗脱液洗脱分步洗脱（stepwiseelution）：用两种或两种以上不同洗脱液分段洗脱梯度洗脱（gradientelution）：梯度改变洗脱液的pH值、离子强度或极性梯度洗脱液的制备装置：梯度混合器、梯度三通阀或简易梯度形成装置梯度形式：直线梯度、阶梯式梯度、凹指数梯度、凸指数梯度以及复合梯度,浓度梯度制造器,6.部分收集及分析柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列试管中或使用部分收集器。这种装置能使每一管按照预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以让流出液通过一个流动小室测定其280nm或260nm的光吸收来进行连续监测。,6洗脱液的分部收集,收集的办法：用小试管每管收集一定的体积，直到洗脱完毕为止。收集的体积（或时间）：随样品的性质、填料、柱子的直径和流动相而变化。一般每管收集的体积为35mL（实验室）。收集的总体积：离子交换层析为床体积的3倍；凝胶层析为1个床体积,6）洗脱液的检测和合并分部收集的试管内的化合物需要进行定性或/和定量鉴定。鉴定的方法根据目的物的性质而确定。小分子化合物：脂类、糖类和氨基酸薄层层析或纸层析显色反应。大分子化合物：蛋白质和核酸分光光度法测定光吸收值。蛋白质：280nm；DNA和RNA：254nm。洗脱液可通过紫外检测器进行连续监测，并将结果由记录仪描绘出来；根据吸收曲线收集、合并相关试管的洗脱液，以进一步处理。,第三节色谱条件及色谱分离纯化工艺的最优化,色谱条件及色谱分离纯化工艺的优化非常关键，即使是相同的仪器和色谱柱，用不同的工艺，所分离和纯化的效果也不一样。,第三节色谱条件及色谱分离纯化工艺的最优化,用色谱法来解决预分离和复姓便成为色谱工作者当今快速分离和纯化及降低治疗蛋白或诊断蛋白的一个热门研究课题。,需要优化条件,固定相:种类颗粒孔径流动相:组分恒定组分变化柱尺寸流速洗脱方式质量回收率活性回收率发酵工艺对纯化工艺影响很大。例如:白细胞介素-2的发酵过程中,用正亮氨酸替代蛋氨酸,可使产物发生不可预计免疫遗失,从而得到非均一性产品.如在发酵介质中加入低浓度的异亮氨酸或蛋氨酸，这种馋和作用可以去除。,如何优化色谱条件,首先选择色谱柱类型然后选择色谱柱的填料（颗粒和尺寸）接着确定柱尺寸的大小接着选择流动相（组成、流速和洗脱方式）最后一旦选定了几种不同色谱的最优化条件，接着便是如何将这些单元进行组合以得到最佳分离和纯化工艺了。最优化要以产品质量和经济效益为目的。,线性放大,固定以下条件1.相同线行流速2.相同缓冲液3.相同填料4.相同柱高5.相同样品浓度和pH6.相同样品体积和柱床体积比例7.相同梯度体积和柱床体积比例放大1.柱直径2.体积流速3.上样体积,开发纯化工艺的注意点,建立检测方法确立目标(纯度和产量)目标蛋白的性质使用不同原理的纯化方法减少步骤尽量减少每步之间样品条件的改变选用高选择性的方法-提高效率快速去除蛋白水解酶在早期步骤中缩小样品体积工艺方法尽量简单!,第四节蛋白质的色谱复性与纯化,一各种液相色谱的蛋白质复性法优点：1.快速去除变性剂；2.由于色谱固定相变性蛋白质的吸附，可明显地减少甚至完全地消除变性蛋白质分子在脱离变性剂的环境后的分子聚集；3.在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；4.便于回收变性剂。目前用于蛋白质复性的LC方法包括HIC、IEC、SEC、AFC4种。,1.IEC,2.AFC,AFC（亲和层析法）,利用配体与目标蛋白质间的特异性的亲和作用，使变性蛋白质保留在柱内的顶端从而与变性剂分离。然后再使变性蛋白质在洗脱过程中进行复性。依AFC柱端基不同，可将其分为固定化金属亲和色谱（IMAC），脂质体亲和色谱和分子伴侣亲和色谱。,3.SEC,SEC(空间排阻色谱）,复性机理：在变性蛋白质进入柱顶端时，因有高浓度变性剂的存在，变性蛋白质分子有一个随机的构象状态和大的动力学水合半径，不能进入柱的空隙，蛋白质在SEC柱上不保留。当使用复性缓冲液时，因其逐步取代变性剂并使蛋白质降低，使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态，这些蛋白质就自发地向热力学稳定的低能态-即蛋白质的天然状态转化，从而使蛋白质开始复性。随着时间推移，当蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质在两相间分配逐渐增加。当蛋白质进入填料的空隙后，其扩散速度减缓，从而限制了蛋白质的聚合，这样就减少了沉淀产生。,4.高效疏水色谱（HIC）,原理：在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。,HIC的特征,对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团，孔径在25100um避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离物质的生物活性。具有“一石四鸟”的作用，尤其是纯化大肠杆菌表达产物时具有除去变性剂（盐酸胍）、使蛋白质折叠（复性）、去除杂蛋白、便于变性剂回收。,蛋白质复性过程,变性与复性同时进行的装置,HIC：采用高盐时上样、低盐时洗脱。故大多在硫酸铵沉淀或离子交换层析后使用。洗脱条件温和-降低盐浓度调整溶液的pH可调整该蛋白的疏水性，因为蛋白在接近等电点时具有最大的疏水性。,疏水柱经过再生后，通常可使用20-30次；具有高蛋白质的结合容量（10-100mgml）；操作简单，自动化程度高；产业化程度极高，目前正广泛用于生物制药。,二、各种复性方法的比较,SECIECAFC,中压或常压色谱,HIC,高压色谱,慢快,负荷受限、分离效果差；负荷高，分离效果好，盐酸胍使用受限；使用范围窄，成本高，手续繁杂，时间长质量和活性回收率大于90%，较理想的复性纯化手段。,二各种色谱复性方法的比较,分类:刚性基质硅胶的高压液相色谱和其他非刚性的中压色谱和常压色谱.SEC固定相:变性蛋白质分子在洗脱过程中,分子体积逐渐减少而进入SEC添料中而保留,因而蛋白质先洗脱,而变性剂最后流出SEC柱.SEC的分效果是LC中最差的,故用于纯化蛋白质不够理想.IEC固定相:与SEC比较,IEC的柱负载高,且变性蛋白质分子可与固定相作用使变性蛋白质在色谱填料的表面吸附,减少了由分子之间的聚集而产生沉淀趋势,SEC强,且分离效果好于SEC.通常在IEC上进行蛋白质复性过程中,盐酸胍易滞留于层析柱中,影响分离,AFC固定相:缺点:只对少数几种蛋白质有亲和作用,难以产业化,所需要的时间很长.专一性高.HIC固定相:进行梯度洗脱,实验室和产业化均适合,在蛋白质复性过程中,能与折叠中间体进行较为理想的分离,复性与纯化可同时进行.,蛋白质复性与同时纯化装置,色谱法缺陷:均不能完全防止在使用流动相置换变性剂时可能产生的变性蛋白质分子间的聚集所形成的少许沉淀分离柱压上升,无法进行分离.提出短柱理论和色谱分离用于蛋白质纯化与分离:研制不同规格的变性蛋白质复性与同时纯化装置.制备型色谱柱在工业生产规模上进行蛋白质复性及同时纯化受到限制的原因-柱压过高,装置,影响色谱复性的因素,固定相，流动相的组成,温度,pH，变性剂等对蛋白质复性起着重要的作用。例如：-葡萄糖苷酶使用稀释复性的最佳浓度-5ug/ml,使用IEC时，最大浓度可达5mg/ml，上样量增加1000倍。缺点：浓度过高会产生沉淀现象。,7265,58110,9540,8426,7265,58110,9540,8426,HS,26,HS40,58SH,SH65,HS72,SH84,95HS,HS110,天然状态有催化活性,-S-S-恢复,正确配对,有活性,非折叠状态,无活性,-S-S-被还原成半胱氨酸残基,-巯基乙醇和尿素对RNase的作用蛋白质的变性与复性,中间体,必须在层析柱上的停留一段时间,应用举例,RPLC是利用溶质分子中非极性集团与非极性固定相间相互作用力大小与溶质分子极性集团与流动相中极性分子在相反方向上相互作用力大小的差异进行分离的。,非线性色谱的相关知识,色谱法的基本特点：1.分离效率高2.应用范围广3.操作参数多4.高灵敏度在线检测5.快速分离6.连续自动化操作,非线性色谱的相关知识,色谱的