生物化学-第三章核酸化学

第三章核酸化学,NucleicAcidchemistry,1.核酸的化学组成结构及其性质2.核酸的测定方法3.核酸的研究技术,重点：,1.RNA.DNA一级结构的测定原理与方法2.双螺旋结构要点，三叶草结构要点3.核酸研究的常用技术及应用4.核酸含量的测定原理与方法,难点：,1.DNA一级结构测定的原理与方法2.核苷酸的两性离解3.双螺旋结构的要点,教学目的,1868年，F.Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质，即现在被称为核酸的物质。,核酸的种类和分布,核酸分为两大类：脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）,核酸的功能,1、DNA是遗传信息的载体2、RNA的功能参与遗传与进化参与蛋白质的生物合成参与RNA转录后的加工修饰参与基因表达调节催化等,第一节核酸的组成成分,一.元素组成,CHONP(9%-9.9%),RNA:P-9%,DNA:P-9.9%,核酸的组成单位：核苷酸核酸的组成成分：碱基，戊糖，磷酸,二.组成成分及组成单位,（一）、戊糖,组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。,（二）、碱基,1.嘌呤（Purine）碱,嘌呤（Purine）,2.嘧啶（Pyrimidine）碱,嘧啶（Pyrimidine）,胞嘧啶Cytidine,C,T,H3C,胸腺嘧啶Thy,(三)、核苷（nucleoside）,核苷戊糖+碱基糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键,（四）、核苷酸（nucleotide）,（五）.核苷酸衍生物,1.继续磷酸化,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,2.稀有碱基,7-甲基鸟苷m7G,取代核苷的表示方式,假尿苷（）,次黄苷（肌苷）I,黄嘌呤核苷X,二氢尿嘧啶核苷D,3.环化磷酸化,cAMP,cGMP,4.肌苷酸及鸟苷酸(强力味精),第二节、RNA的分子结构,一、RNA的一级结构,（一）连接方式,5PdAPdCPdGPdTOH35PAPCPGPUOH或5ACGTGCGT35ACGUAUGU3ACGTGCGTACGUAUGU,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,DNA,RNA,(二)、RNA的降解,1、RNA的化学降解,碱降解：RNA用稀碱降解产物为2-核苷酸和3-核苷酸混合物。DNA抗碱(高温不抗碱)酸降解：水解速度糖苷键脂键嘌呤糖苷键嘧啶糖苷键脱氧核糖糖苷键核糖糖苷键在低温的酸性条件下DNA，RNA则稳定,2.酶法降解,核酸酶有:外切酶，内切酶和磷酸酯酶,（一）RNA的二级结构,二.RNA的高级结构,占RNA总量的15一种氨基酸对应最少一种RNA分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3-末端都具有CpCpAOH的结构。,1.特点,2.三叶草结构要点,（二）tRNA的三级结构,第三节DNA的分子结构,一、DNA的一级结构及测定,1.加减法,2.双脱氧法,dNTPddNTP的比例最好为1100,3.化学修饰法,修饰及断裂条件,二.DNA的二级结构,要点：1.多核苷酸链的走向2.螺旋的角度.高度.直径3.碱基分布及配对规律4.作用力,（一）双螺旋提出的基础,（二）双螺旋结构要点,双螺旋DNA的结构参数,（三）双螺旋的结构类型,（四）左旋DNAZ-DNA,要点1.左旋锯齿状2.碱基向外3.只有小沟4.12bp，4.56nm,（五）.绞链DNA（hing-DNA即H-DNA,三、DNA的三级结构,第四节核酸及核苷酸的性质,一、溶解性,DNA在PH4.2时溶解度最低。RNA在PH2-2.5时溶解度最低。,1.水溶性,微溶于水，不溶于有机溶剂,水中溶解度DNA达2%，RNA达4%,2.盐溶性,DNA-蛋白，溶于1mol/LNacl，低盐不溶。RNA-蛋白，溶于0.14mol/LNacl，高盐不溶。,3.不同PH的溶解性,二.两性性质,1.腺嘌呤,2.鸟嘌呤:,4.尿嘧啶胸腺嘧啶,3.胞嘧啶,三、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光,四、核酸的变性与复性,（一）.变性,变性:稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。变性表征:生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素:pH（11.3或5.0）变性剂（脲、甲酰胺、甲醛），低离子强度加热,热变性和Tm:,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)*2.44,（二）.核酸的复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。退火温度Tm25复性影响因素片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/纯度/溶液离子强度,（三）.核酸的复性与分子杂交,第五节核酸及其组分的分离纯化与测定,一.分离纯化的一般原则,1.防止核酸酶降解2.防止化学因素降解3.防止物理因素降解,二.DNA的分离纯化,三.RNA的分离纯化,四.核酸组分的分离纯化,1.离子交换法：,四种核苷酸之间的分离采用离子交换法阳离子交换剂洗脱次序：,阴离子交换剂洗脱次序：,2.凝胶过滤法:,碱基,核苷,核苷酸之间的分离采用Sephadex-G10/G25,核苷一磷酸,核苷二磷酸,核苷三磷酸的分离采用柱层析和薄层层析法分离.柱层析洗脱次序AMPADPATP薄层层析迁移次序AMPADPATP,3.DEAE-纤维素法:,五.核酸及其组分含量的测定与纯度测定,（一）.核酸含量的测定方法,1.紫外吸收法,1ug/mlDNAA260=0.021A260=50Ug/mlDNA1ug/mlRNAA260=0.022-0.0241A260=40Ug/mlRNA,2.定糖法(20-250ugRNA,40-400ugDNA),3.定磷法(10-100ug核酸),4.凝胶电泳,EB(0.5ug/ml)染色,最小检出量1ng,（二）.核酸纯度的测定,1.紫外吸收法,测定A260与A280,2.凝胶电泳,3.等密度梯度离心,凝胶电泳,等密度梯度离心,第六节核酸研究的常用技术,一.DNA的凝胶电泳,（一）琼脂糖凝胶电泳,1.琼脂糖凝胶浓度及选择2.琼脂糖凝胶电泳的分辨率3.琼脂糖凝胶电泳的用途(分离,测量,回收,印迹),（二）PAGE电泳,1.PAGE浓度及选择2.PAGE电泳的分辨率3.PAGE电泳的用途,（三）影响凝胶电泳Rf值的因素,1.分子大小2.分子构象3.凝胶浓度4.电流电压5.温度,二.印迹技术与分子杂交,（一）.印迹技术,概念:核酸的杂交中，经过凝胶电泳分离的DNA/RNA分子，杂交之前通过毛细管吸附作用/电导作用将凝胶中DNA/RNA分子原封不动地转移到滤膜上。,滤膜:硝酸纤维素滤膜，DEAE-纤维素滤膜,印迹种类:,Southernblotting:（1975）Northernblotting:（1979，Alwine)（1979，Towbin,Immunoblotting-Western;1982,Reihart,Eastern)电转移技术:(1983,Aubertin),（二）.核酸杂交,核酸杂交的概念:DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。,核酸杂交方法：Southernblotting杂交技术:Northernblotting杂交技术:点杂交技术:菌落/噬菌体的原位杂交技术:,（三）.杂交检测方法放射自显影,点杂交,三.PCR技术-DNAPolymeraseChainReaction,（一）基本步骤,（二）PCR技术的应用,1.遗传病，疑难病的诊断及产前检查2.病原体的检测3.癌基因的检查4.基