《本科生实验指导》PPT课件

实验指导,指导老师：习欠云,实验十一外源基因在大肠杆菌中的表达,实验目的了解IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖）诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。,实验原理将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。没有加入IPTG诱导剂的时候，lac产生的阻遏蛋白与lac操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制：当加入IPTG后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行初步鉴定。,Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolitegeneactivationprotein)因子和cAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。,乳糖启动子,实验内容,材料：大肠杆菌菌株DH5和BL21以及表达载体PET-32（+）主要试剂：LB平板（含50g/ml的卡那霉素），100mMIPTG,10mg/ml的溶菌酶（10mMTris-HCl,pH8.0配制）。Amp（氨苄青霉素）贮存液：用三蒸水配成100mg/ml,用0.22m滤膜过滤除菌，分装后-20保存。LB液体培养基：10gTrptone,5gYestExtract,10gNaCl,加去离子水定容至1000ml,高压灭菌，冷却后4保存。LA液体培养基：10gTrptone,5gYestExtract,10gNaCl,加去离子水定容至1000ml,高压灭菌，待灭菌好的培养基温的度降至60左右时，加入Amp至浓度100g/ml，4保存。,LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%（wv)，高压灭菌，冷却至约50后分装如灭菌平皿中，凝固后4保存。LA固体培养基：待灭菌好的LB固体培养基的温度降至60左右时，加入Amp至终浓度100g/ml，摇匀后分装入灭菌平皿中，凝固后4保存。50TAE:750ml去离子水中加入242gTris,57.1ml乙酸，Na2EDTA37.2g,用去离子水定容至1000ml。IPTG（1molL):8ml去离子水溶解2.3831gIPTG后定容至10ml，再用0.22m滤膜过滤除菌分装入1.5mlEppendenf灭菌离心管中，-20保存。,实验仪器与设备空气摇床，生化生化陪养箱Eppendenf5804R低温高速离心机EppendenfGentrifuge5410D台式高速离心机EppendenfBiopHotometerMETTLERTOLEDOAB204-E分析天平TS-1脱色摇床超净工作台水浴摇床垂直电泳槽凝胶成像系统,操作步骤,1大肠杆菌BL-21感受态细胞的制备。2重组质粒pET-32（+）-actRB转化到大肠杆菌BL-21细胞。3将含有重组表达载体pET-32（+）-actRB和空表达载体pET-32(+)的大肠杆菌BL21划线接种在LB平板上，37培养过夜，直至平板上生出菌落。4挑取单菌落至5mlLB液体培养基中，培养至OD600=0.6左右，4放置过夜。5将LB-PET-32（+）-actRB菌液接种到3mlLA液体培养基中，37，200rpm振摇培养过夜。6取100L培养过夜的菌液接种到3mlLA液体培养液中，37，200rpm振摇培养至OD600至0.6-0.8时，加入1M的IPTG,使IPTG终浓度分别为1mM,置37摇床继续诱导培养6h，收集菌体置-20保存备用。7另取不含目的基因片段的质粒pET-32（+）转化BL21感受态细胞做相同处理，加IPTG诱导6h作对照。,注意事项,1大肠杆菌的表达水平与IPTG浓度、诱导时间、温度以及宿主菌的生长状体有关。当表达量不高时，可以调节IPTG的浓度、诱导时间和温度，甚至重新转化。2菌液的OD值要摇到0.6-0.8，否则会直接影响到蛋白的表达量。,思考题,1、哪些因素会影响大肠杆菌的表达？2、IPTG诱导蛋白表达原理？,实验十二目标蛋白的PAGE检测,实验目的了解蛋白质分离纯化及检测方法,实验原理不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如二巯基乙醇）共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDS结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合SDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS-PAGE电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联体N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可以及时观察电泳分离的效果。,实验试剂30%（w/v）凝胶贮存液：丙烯酰胺29g，亚甲基双丙烯酰胺1g，加ddH2O溶至100ml，用新华3号滤纸过滤，棕色瓶中4保存，（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口罩）。1.5mol/LpH8.8Tris-HCl、0.5mol/LpH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED。Tris-甘氨酸电泳缓冲液，pH8.3，可配成5贮存液备用，临用前稀释。工作液5贮存液Tris碱25mmol/LTris碱15.1g甘氨酸250mmol/L（pH8.3）甘氨酸94gSDS0.1%10%SDS50ml加ddH2O定容至1000ml,样品处理液Deionizedwater3.8ml0.5mol/LTris-HClpH6.81.0mlGglycerol0.8ml10%（w/v）SDS1.6ml2-mercaptoethanol0.4ml1%（w/v）bromophenolblue0.4ml染色液0.4%考马斯亮蓝-R250染色液甲醇400ml冰乙酸100ml考马斯亮蓝R2501g加ddH2O定容至1000ml脱色液甲醇400ml冰乙酸100mlddH2O500ml,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液配方,（1）30%凝胶贮备液：29%丙烯酰胺，1%亚甲基双丙烯酰胺，用去离子水配制后0.45m的硝酸纤维素膜过滤，4避光保存。每隔几个与须重新配制。（2）10%SDS：用200ml水溶解25g电泳级SDS，加热到68并用磁力搅拌器搅拌至溶解，加入浓HCl调节pH值至7.2，再定容至250ml，室温保存。（3）10%过硫酸铵：在5ml水中溶解0.5g过硫酸铵。（AP，新鲜配制）。（4）Tris-甘氨酸电泳缓冲液（5）：在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸，然后加入50ml10%电泳级SDS贮存液，用去离子水定容至1000ml后常温保存。,（5)2SDS凝胶上样缓冲液：在40ml去离子水中溶解1.211gTris碱、20ml甘油、4gSDS、3.1gDTT与10mg溴酚蓝，用1mol/LHCl调节pH值至6.8后加入去离子水定容至100ml，-80保存。（6）考马斯亮蓝染色液：200ml甲醇，50ml冰乙酸，0.5g考马斯亮蓝R250,250ml去离子水。用Whatman1号滤纸过滤后室温无限保存。（7）脱色液:250ml甲醇，80ml冰乙酸，680ml去离子水。（8）1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）分离胶缓冲液：18.165gTris碱，溶解于40ml水后用1mol/LHCl调节pH值至8.8，加水定容至100ml后用0.45m滤膜过滤4保存。（9）1mol/LTris-HCl（pH6.8）积层胶缓冲液：12.11gTris，溶解于40ml水后用1mol/LHCl调节pH值至6.8，加水定容至100ml后用0.45m滤膜过滤4保存。,实验操作,（1）样品处理取1ml菌液，10000rpm离心1min，弃上清，重悬于50L去离子水，加入50L2SDS凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，100加热10min，10000rpm离心3min备用。（2）SDS-PAGE凝胶的制备按下列配方组成配制4ml12%分离胶12%的蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离层配方成分体积/mL水1.630%丙烯酰胺混合液1.321.5mol/LTris（pH8.8）110%SDS0.0410%过硫酸铵0.04TEMED0.002,一旦加入TEMED,混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中，注意为浓缩胶留有足够的空间（约1/3空隙体积）。轻轻在其顶层加入1ml去离子水，阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用并磨平胶平面。聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的水，用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。按下列配方组成配制1ml5%浓缩胶5%的蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩层配方成分体积/mL水0.67530%丙烯酰胺混合液0.16751.0mol/LTris（pH6.8）0.12510%SDS0.0110%过硫酸铵0.01TEMED0.001将浓缩胶灌入分离胶上面，插入梳子，垂直放置于室温下,浓缩胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳子。将凝胶放入电泳槽上，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。（3）电泳安装好电泳槽，把电泳槽置于冰盒内，将电极插头与适当的电极相连。开始时电压为60V，染料进入分离胶后，将电压增加到90V，继续电泳直到染料到达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓慢旋转3-4h或过夜。换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动4-8h，其间换液3-4次。继续脱色，直到满意为止。用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。,注意问题,（1）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片效果也不会好的。（2）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液,且量要足够,否则甲醇挥发很快,胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中保存.半个月应该没问题；分子克隆：长期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤其是在水里，3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索了。胶一般应放20%的甘油中长久保存（见“分子克隆”）,影响蛋白质电泳分离效果的因素,1、蛋白质样品中的盐浓度影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白质时最好用去离子水，再加等量2SDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行SephaderG25过柱。2、SDS质量由于变性蛋白质是与SDS结合而带负电荷，蛋白质结合SDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同