质粒酶切`鉴定.ppt

质粒酶切、鉴定及DNA片段的凝胶回收,一.实验目的,1.了解质粒酶切及电泳鉴定原理。2.掌握核酸片段的凝胶回收纯化操作技术。,第一部分,质粒的酶切及电泳鉴定,一.实验原理,限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA片段。如：EcoR和Hind的识别序列和切口是：EcoR：GAATTCHind：AAGCTT,限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。,_,+,酶切反应系统包括：DNA，酶，buffer，灭菌水注意：不同公司的酶和buffer系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和buffer。1，DNA：自己制备的DNA，样品中不应该有酚，氯仿，酒精，EDTA，盐离子等的污染，以免影响酶的活性。2，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的1/10。(因为酶是储存在50%甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置)。3，buffer：不同的酶配有不同的buffer，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种buffer，有些buffer中需要另外添加BSA。,4，反应体积，通常1到几微克DNA的反应体积可以控制在50到100微升，用20单位的酶来切。5，反应条件，大多数酶都是37度半小时以上。6，双酶切因为不同的酶需要不同的buffer，所以有两种情况：1)两种酶是同样的buffer。尽量用同一个公司的酶，这样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。2)两种酶是不同的buffer，先用一种buffer离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的buffer再酶切。,二.仪器和试剂,1主要仪器（1）1.5mL塑料离心管（2）微量加样器10L、100L、1000L各一支（3）台式高速离心机（12000r/min）（4）水浴锅、电泳仪、电泳槽2材料重组质粒pMD19-b（插入外源基因大小约500bp）,3试剂（1）限制性内切酶BamHI、Hind及缓冲液K；（2）1TBE缓冲液：称取Tris10.88g、硼酸5.52g和EDTA0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，用前稀释10倍。（3）EB染色液：终浓度为0.5g/mL。,三.操作步骤,H2O5.5l质粒DNA(100ng/l)15l10酶切缓冲液(Kbuffer)2.5lBamH(5U/l)1lHind1l,2.37水浴3h-4h。3.将Eppendorf管置65水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应，或加入2ulloadingbuffer终止反应。,混匀(12000rpm离心5sec),1.反应体系的建立:（25l体系）,4.DNA琼脂糖凝胶电泳检测,质粒酶切电泳图,质粒DNA,酶切图,操作注意事项：1.吸样量一定要准确;2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶;3.要求在冰上操作，并充分混匀;4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染;5.样品在37与65保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。,重组所用质粒载体（2.692kb）,pMD19载体结构,第二部分,DNA的凝胶回收,传统的DNA回收的方法主要基于降低凝胶的熔点以释放DNA，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收。现多用公司生产的商品化的试剂盒，其原理是采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的NaI）融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA。本次实验采用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收。,实验原理,仪器和试剂,1.仪器：电泳仪，水浴锅，离心机2.材料：酶切的DNA样品3.试剂：,北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产的B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒Cat.NO.MK005,按凝胶重量：溶胶液=1:3加入溶胶液,60溶胶10min-20min,将溶胶液转移至吸附柱,12,000rpm离心30s，弃废液,加入500ul漂洗液,12,000rpm离心2min,弃废液，重复3次,1,2,3,4,5,加入20ul洗脱液，静置5min,吸附柱移至新的1.5ml离心管,12,000rpm离心5min,弃洗脱柱，保存样品,DNA酶切条带回收步骤,回收电泳图,约2690bp,约600bp,DNA片断的连接,实验六,二.实验原理(质粒酶切与鉴定),DNA片段之间的连接主要是在T4DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来,需ATP。,学习核酸片断连接的原理和方法,一.实验目的,连接酶：把基因连在一起,1、连接缓冲液的影响：1）20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；2）10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；3）1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，4）25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。5）0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。注：含有ATP的缓冲液应于-20保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。,影响DNA连接反应的因素,2、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统上将连接温度定为16，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得较好的连接效果。3、酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍。4、DNA浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物，DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。要求线性化的连接产物，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。,仪器和试剂,1.仪器：离心机，水浴锅2.材料：回收的DNA样品3.试剂：1）T4DNA连接酶2）10XT4DNAligasebuffer：Tris-HCl（pH7.6）；MgCl2；DTT；ATP。,三.操作步骤,载体DNA（大片段）：6l；插入片段（小片段）：2l；10T4DNAligasebuffer：1l；T4DNA连接酶：1l,2）4反应过夜（16h）。,1）连接反应液的制备（10ul体系）：,注意：DNA纯化回收后,电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带,那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带。这时可以进行重复纯化回收。2.当连接反应难以进行时