《质粒DNA提取鉴定》PPT课件

质粒DNA提取、鉴定,暨大医学院生化教研室,质粒（plasmid）存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。与染色体相比，质粒结构简单，分子大小不等。小的不到1.0106道尔顿，大的则超过200106道尔顿。,质粒含有某些染色体所没有的基因，编码某些功能蛋白质（表达某种遗传性状，如抗药性（抗氨卞青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等等）。即很多质粒往往都赋予其宿主细胞一定的表型。,质粒分类：严紧型（每个细胞15个质粒）质粒的复制与宿主染色体复制同步进行，因而一个宿主细胞中只有一个或几个质粒拷贝。当宿主蛋白合成被抑制，染色体复制停止，质粒的复制也停止；松弛型（每个细胞10200个质粒）质粒的复制受“松弛型控制”。当宿主蛋白质合成受抑制（如加入氯霉素），染色体复制停止时，质粒仍可大量复制。此时，一个宿主细胞中质粒数目可多至数千个拷贝。,具备基因工程质粒载体的条件：多克隆位点（multiplecloningsite,MCS),一段短的序列上有多种限制性内切酶切口，每种只有一个切口。选择性标记，如抗药性。本身分子量不宜过大，有一定容量。有一定的抄本数（copynumber）每个宿主菌可能容纳的最多质粒数。,pBR322质粒(4.36kp),最早应用于基因工程的载体，现在仍在广泛应用。序列已全部清楚数十个内切酶位点2个抗药基因,pBR322质粒(4363bp):主要包括：限制性内切酶位点（插入外源基因）；含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。,pBR322共有种限制性内切酶的单一的识别位点，其中种酶（EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII,NruI）的识别位点位于四环素抗性基因内部，种酶（ClaI,HindIII）的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这个限制性内切酶位点上插入外源通常都会导致四环素基因（tetr）的失活。种酶（ScaI,PvuI,PstI）在氨卞青霉素抗性基因（ampr）内具单一的识别位点，在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。,pUC18/19pUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体。即是将组建13系列载体所用的LacZ片段插入到pBR322的一种缺失变种之中。E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为半乳糖苷酶的片段。LacE.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的片段.单独存在的或片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（-互补)。,互补的检测,片段,片段,片段,pUC18/19含有来自pBR322质粒复制起始点（ori），氨卞青霉素抗性基因（ampr）以及大肠杆菌半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码肽链的序列，并且在Lac基因中有一段多克隆位点（）区段。另外与pBR322相比，pUC质粒载体具有更小的相对分子量。而且无控制质粒复制的rop基因，使得其拷贝数大增。每个细胞可达500-700个拷贝。因此，由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆分子。pUC18/pUC19区别在多克隆位点以互为相反的方向排列，余相同。,当外源的DNA片段插入到多克隆位点时，使互补链破坏形成的是无活性的半乳糖苷酶，于是被转化的大肠杆菌细胞，就在Xgal-IPTG培养基上形成白色菌落，而相反没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞，在Xgal-IPTG培养基上形成蓝色菌落。,本次实验用pEC-CT,pEC-CT在pcDNA3基础上构建,pEC-ct质粒：8.0kb有Hind,BamH酶切点，可切出CD基因（1.2kb）,质粒DNA提取和纯化步骤：,培养细菌收集和裂解细菌纯化质粒DNA,细菌的培养,细菌培养,从-20取出储存菌液，斜面划线接种于培养板。2.单克隆培养：挑取单个菌落，接种到培养瓶中，37培养24h。,3.扩大培养：培养液3ml,接种于60mL的LB培养液（含Amp50g/ml),振摇200rpm，37(4-6h),使A5800.4-0.6。4.加氯霉素：加氯霉素，终浓度40g/ml，继续培养15-17h.,本次实验用碱裂解法提取DNA包括：1.菌体收集2.菌体裂解、质粒DNA提取、纯化3.鉴定,2人一组,原理：碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。,1.取6个1.5mlEppendorf管，分别加入细菌培养液1.4ml9000rpm2-3min弃上清2.600lSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管再用200lSTE液清洗各管，清洗液合并一管（收集菌体）9000rpm2-3min,弃上清（保留菌体）,收集菌体,600ul,123456,200ul,3.沉淀悬于200ul溶液I，枪头吹打混匀放置5min4.加入400ul溶液II，颠倒EP管2030次（动作轻!！）放置5min5.加入300ul溶液III，充分混匀（温和操作）10min,沉淀蛋白质和染色体DNA,裂解,碱裂解法提取质粒DNA,溶液I,成分：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；Tris-Cl溶液：控制溶液的pH，50mM葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA：是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长,溶液II,成份：0.2NNaOH/1%SDS；为保证NaOH不因吸收空气中的CO2而减弱其碱性，最好用新鲜的浓NaOH稀释后和2的SDS等体积混合后使用的。NaOH：溶解细胞。之所以叫碱裂解法，即是因为NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，都会在瞬间溶解，细胞从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化。SDS：结合蛋白，平均两个氨基酸结合一个SDS分子，,加溶液II要记住两点：1.时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；2.操作必须温柔，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会混入质粒DNA中，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。,溶液III,成份：3M醋酸钾/2M醋酸3M醋酸钾：SDS十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate，PDS），而PDS是不溶的，溶液III加入使钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，SDS结合了大量蛋白质，PDS就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，2M的醋酸：中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。,12000rpm3min弃沉淀6.将上清转移至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇(540ul)，颠倒混匀室温5min离心12000rpm10min弃上清沉淀干燥，室温10min7.加TE500ul溶解沉淀,同时倒胶1%,330ml/小班,沉淀质粒,PDS沉淀的形成不能将所有的蛋白质沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。,8.加入等体积饱和酚，振摇1min，充分混匀12000rpm5min9.将上层水相转移至另一Eppendorf管中，用等体积氯仿-异戊醇抽提，振摇1min，充分混匀12000rpm5min10.将上层水相转移至另一Eppendorf管中，加入预冷的2.5倍体积无水乙醇-2030min,纯化质粒,易错,酚/氯仿/异丙醇,酚：蛋白质的变性作用远大于氯仿，可最大程度将蛋白质抽提掉，但是在高浓度的盐溶液中，离心后酚会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；我们单独用酚抽提酚，会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。,也可用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。加入2.5倍体积的乙醇，-20放置，离心就可以将质粒DNA沉淀出来。,离心12000rpm15min弃上清沉淀干燥11.加入TE50100ul,溶解沉淀（反复吹打至完全溶解）,EP管上做记号,质粒的分离、纯化,半定量检测浓度,酶切,电泳鉴定,鉴定质粒提取质粒、单酶切、双酶切样本一起电泳，与marker比较，估计质粒大小。线性化（单酶切）：用Hind将质粒酶切、电泳，估计其分子大小。双酶切：用Hind和BamH将质粒pEC-CT所含的CD基因1.2kb片段切出。,鉴定(质粒分子量、纯度及是否含有所需要DNA段)(一)酶解双酶切体系：25ul单酶切体系：25ulsample5ulsample5ulBamH1ulHind1ulHind1ul10buffer2.5ul10buffer2.5ulddH2O15.5ulddH2O16.5ul混匀，离心(瞬时)，37,DNA浓度测定溴乙锭荧光法(半定量法，一大组/板),（1）制备1%琼脂糖凝胶（塑料平皿中）凝固待用。（2）点样：标准溶液:1.00.50.250.10.050.0250.01ug/ul分别吸取1ul点于制好的琼脂板上样品：吸取1ul，滴加于琼脂板上。(3)浓度测定：避光，小时后，在紫外灯下观察各点荧光强弱，从而估计样品DNA浓度。,电泳,1.制胶:1%2.点样（1）质粒提取液5ul+TE20ul（2）单酶切液25ul（3）双酶切液25ul各加溴酚兰染色液5-6ulMarker老师加每小组（2人）3道，Marker1道,3.电泳电压：120V2min100V1.0h待溴酚蓝走至6-7cm左右，终止电泳。观察结果：紫外灯下，照相。,markerDL15000:15000,10000,7500,5000,2500,1000,250bp上样液：50甘油、0.25MEDTA,0.05%溴酚蓝，pH8.0,琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但碱法抽提得到质粒样品中几乎不含线性DNA。这三条带以电泳速度的快慢排序，分别是超螺旋、开环和复制中间