《荧光原位杂交更新》PPT课件

荧光原位杂交技术,简介,原位杂交技术（insituhybridization，ISH）Gall和Pardue1969年建立。用标记的DNA或RNA作为探针，对组织细胞内的核酸或有丝分裂中期的染色体进行原位检测和观察。最初的探针大多以同位素3H、32P等标记，但因同位素标记探针对人体有放射损害、实验周期长、放射自显影的分辨率有限、环境污染等缺点，给研究及实际应用带来了诸多不便。,荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）利用荧光物质标记探针（直接或间接），再进行杂交，可通过荧光显微镜对靶序列进行定性、定位和定量分析FISH技术的应用已经证实或发现了用经典细胞遗传学方法无法证实或发现的肿瘤染色体改变，成为衔接细胞遗传学和分子遗传学之间的一座桥梁。开创了一个新的学科分子细胞遗传学。,杂交流程,a.两要素：探针和靶序列b.标记探针直接标记和间接标记c.变性探针和靶序列成为单链d.混合杂交e.间接标记的探针需连接荧光基团的步骤,FISH,荧光原位杂交特点,与其它原位杂交技术相比，FISH的优点：经济安全，快速方便；敏感性高，特异性强，背景低；宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色；使用G带玻片可作出回顾性分析；缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。,基因特异探针靶向每条染色体只有一个拷贝的DNA序列。主要用于间期或中期染色体中识别染色体易位、倒位、重复和缺失、邻近基因综合征、标记染色体和染色体扩增等，可检测基因的扩增和重排。,常用探针类型基因特异探针,常用探针类型重复序列探针,重复序列探针的结合位点是基因组中多拷贝的短重复碱基对序列（例如着丝粒和端粒探针）所在的染色体区域。着丝粒常常是A-T丰富区，而端粒已知含有TTAGGG序列。由于重复序列相对容易制备和分辨率较高（0.5Mb），这种FISH被普遍用于筛查一般的染色体非整倍体、亚端粒缺失和标记染色体。,21三体FISH,常用探针类型WCP探针,全基因组绘画（WCP）探针是一种复合DNA探针。除着丝粒和端粒区外，全基因组绘画探针对全长染色体有高度亲和力。这些探针最适用于识别中期染色体的基因组不平衡，尤其是在许多癌症中观察到的复杂染色体重排。M-FISH用特殊选择的窄带滤色片连续捕获5种荧光色素中的每一种荧光色素图像；SKY用于荧光色素组合分析的成像设备不同：冷电荷耦合器(CCD)照相机和Fourier变换光谱法相结合，同步曝光成像。这些技术目前在国内一些重点细胞遗传学实验室中开展。,WCP探针（SKY）,技术结合产前BoBS,BACs是人类DNA的长片段克隆序列，典型的150-170kbp，相对于短的DNA探针具有更好的信噪比、不受DNA质量影响、更高的覆盖率。将BACDNA探针耦联至LuminexxMAP荧光编码的微球上，将FISH技术与Luminex技术平台结合，BACs-on-Beads技术可以在同一个微孔内实现多个FISH探针的检测，相对于同时进行成百上千次FISH实验。高通量、标本来源广、快速、结果明确；除了检测13，18，21，X，Y染色体拷贝数目的变化外，还可检测9种常见的微缺失综合征。,技术结合FQ-PCR,来自于分子生物学技术-定量荧光聚合酶链反应和FISH的结合；对染色体13、18、21、X和Y采用荧光引物对染色体特异性高度多态性DNA短重复序列进行PCR扩增，快速诊断非整倍体；特定的基因引物可以检测基因的缺失与扩增检测“有”或“无”和数目异常；位置异常无法判断，如平衡性染色体重排。,几种技术平台比较,细胞遗传学技术的比较,FISH相关项目,羊水细胞荧光原位杂交分析（包括未培养和培养）血细胞荧光原位杂交分析其他各类细胞荧光原位杂交分析SRY等单基因分析胚胎染色体病诊断（PGD）,结合技术相关检测项目,染色体病快速产前诊断（FISH、qPCR、BoBs）产前单基因病诊断SNPArray检测某些代谢病的产前诊断,项目意义,1.快速且准确进行检测较羊水染色体分析，FISH技术可以确定13、18、21、X、Y的染色体数目信息，缓解唐筛阳性患者或高龄孕妇精神负担；缓解医生核型分析工作压力，能够有针对性的对样本进行处理。2.弥补核型检测失败无报告的问题FISH对于样本要求比较低，对于羊水量少、羊水活细胞数目少、孕周偏大、细胞培养失败、核型结果难以判读等各种原因导致的核型分析失败均可针对性的给予弥补，解决占染色体数目异常的80-90%问题。3.FISH与羊水染色体核型分析构成较为完整的染色体异常诊断平台，提高了产科胎儿产前诊断水平。4.BoBs可检测9种常见的微缺失综合征，拓宽了检测范围。,工作基础,探针商品化探针原位杂交仪LuminexxMAP液相芯片检测平台,工作基础,工作人员1）项目负责人刘红卫，男，妇产科实验室技术负责