胶原水解物及其生物学价值

第3O卷第3期明胶科学与技术2010年9月THESCIENCEANDTECHNOLOGYOFGELATINVD3ONO3SEP12010胶原水解物及其生物学价值肖文君译广西师范大学生命科学学院生物技术专业，广西桂林541004原文作者8EFFERT，MD，德国SDDESGHOLSTEIN大学医学部教授胶原是一种特殊氨基酸组成的蛋白质。它不仅是在动物和人体内出现最频繁的蛋白质，还是细胞内结缔组织和支持组织包括软骨最重要的功能构成要素。它之所以能起到如此关键的作用是因为它本身所具有的高弹性。三条含有一个左旋螺旋结构的蛋白质缠绕在一起形成一个右旋超螺旋结构。同时，在每个三元螺旋中根据其含有不同型号与数目大多数是原纤维的纤丝的。除了原纤维胶原I型骨、胶原的结缔组织、型软骨、型网状纤维、V型与I、型结合、型与型结合之外；还有非原纤维胶原，如型牙基层底膜型结缔组织和关节软骨中的珠链丝和X型在细胞周、关节和骺软骨深层以及另外一些存在于皮肤、血管和其它膜上的亚型如、型，型是在软骨中于的A链已经成功地将胶原鉴别为2L类。其中型表面与原纤维连接在一起的。表1胶原和各种类型明胶的氨基酸组成FIAOWJLV163CORN158明胶科学与技术2010年9月胶原和各种类型明胶的氨基酸组成【在天然蛋白中的百分含量N625IEIN16GN必需氨基酸各种胶原类型的多样性表现出蛋白质功能的多样性。而当它们逐渐变成明胶或胶原水解物时，这种多样性就不再重要了，但这对其生物学价值却没有任何影响。另外，由各种不同来源的动物原材料制得的明胶或胶原水解物，在氨基酸组成上并无太大区别。1什么是胶原水解物，7胶原水解物是由胶原组织骨皮和猪或牛皮的下脚料酶法水解后产生的。所以，它是由本质上为同一类必需氨基酸组成的不同多肽的混合物。明胶通常是由经过浸出、抽提、纯化、浓缩、灭菌后的动物胶原材料，在酸或碱性条件下水解后制成的。这种物质由分子量约为100KD的蛋白质组成，并且其特点是具有形成胶冻的能力。胶原水解物在由同种起始物质，同样经过浸出、酶水解、提纯、浓缩、灭菌、干燥等过程后制得。但胶原水解物不能形成胶冻，明胶由分子量为36KD的蛋白质组成，且能溶于冷水。所以总的来说，明胶是水解的胶原，而胶原水解物是一种降解物。它的氨基酸组成与明胶一样，但却拥有不同的理化性质；分子量TG比明胶小且不能形成胶冻。通过比较骨胶原、软骨胶原和小牛皮胶原的水解物后发现，它们的氨基酸含量显然在很大程度上是相同的。胶原母体和胶原水解物在氨基酸组成上有别于其它天然蛋白质。胶原里的精氨酸含量无疑占更高的比例。最大的区别还在于甘氨酸和脯氨酸，在胶3O卷第3期肖文君胶原水解物及其生物学价值L59泵水解物中它们的含量约是其它蛋白质中的三倍见图2。内氨酸精氨酸犬冬酰胺天冬氨酸符氨酰胺符氨酸甘氨酸组氨酸4静脯氯酸静赖氨酸异亮氦酸亮氮酸赖氮酸蛋氩陵苯丙氨酸脯氨酸丝氮酸苏氨酸酪氨酸缬氨陵OBLIIOI，FL妒。T滞赫柳6L。LA吐钒州“封I烈；图2胶原水解物的氨基酸谱然而对于胶原水解物来说，这不仅仅是百胶和各种食物中含有的氨基酸的克数，表2给子比，还是明胶和其它一些令人感兴趣的高蛋出了不同食物中的氨基酸含量。食物中氨基酸的绝对量。根据每LO0克明表2不同食物中氨基酸的含量峥蚌LILI转蛳附M眦哪一栅怖M一一一一一一M黔160。明胶科学与技术2010年9月不同食物中氨基酸的含量100克食物中氨基酸的克数。由上表可知，要想补充与28L牛奶或18KG土豆中所含的等量的甘氨酸，只需摄人10G明胶或胶原水解物。LOG明胶或胶原水解物中脯氨酸的含量相当于110G猪肉、12KG土豆或140G小麦面包。这个比较证实了在为软骨代谢提供所需的最重要的氨基酸上，胶原水解物比其它任何含蛋白质的食物都更为高效且选择性更强。2胶原水解物的生理学价值充足的甘氨酸和脯氨酸供应对于软骨代谢的稳定和再生过程是极其重要的。合成1克型胶原需要超过十亿分子的甘氨酸和6亿2千万分子的脯氨酸。在低蛋白摄入的饮食年龄、慢性病、不均衡饮食或进行耗体力的活动高强度运动、康复过程、生长发育后，这些氨基酸的营养供应将极其缺乏。因此，可能造成软骨代谢同化期的缩短和软骨细胞合成水平的降低。分解过程将占据优势，致使软骨厚度因磨损而变薄。同时科学家还证实了，在软骨细胞中，胶原水解物能直接刺激胶原的合成。胶原水解物的摄人与胶原软骨基质不断增加的合成之间的因果关系也已被有力地证实了。有一种说法认为口服的明胶或胶原水解物在肠内不能被消化，因此不能作为特殊结构的氨基酸混合物被再吸收。这种说法已经被证明是错误的。然而，肠内消化与再吸收功能要素的结合是在软骨内产生药代动力学影响的先决条件。3胶原水解物的生物动力学通过向老鼠喂养明胶，研究证据，明胶和胶原水解物事实上是在肠道内被水解和再吸收的。在与对照组比较后发现，以明胶进行喂养的动物在进食后，其门静脉中脯氨酸、羟基脯氨酸和甘氨酸的浓度显著增加；而人服用了10G胶原水解物后，外周血PERIPHERALBLOOD中这些物质的浓度也显示出了完全相同的结果。于1990年L0月至1991年3月底期间，在随机选取的6O名男性体育爱好者身上，用单盲法SINGLEBLIND进行了安慰剂对照的研究。在四个半月中每天摄入1OG胶原，并连续测量6次外周血中氨基酸的浓度。通过将实验组中甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸的数据与对照组进行比较后发现，这些物质的含量以一种极其显著的方式增加。同时，丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸和色氨酸的含量也较高。这些研究结果证实，明胶或胶原水解物事实上是在肠内第30卷第3期肖文君胶原水解物及其生物学价值。161被消化的，而氨基酸的构成要素则以胶原所特有的形式被再吸收。通过对没有提高胶原富含组分营养供应的实验组和安慰剂组的比较后得知，氨基酸的浓度和食物摄人量息息相关。摄取没有添加胶原的普通食物会导致血浆中对胶原特殊氨基酸含量的下降，并造成软骨细胞合成部位供应的减少。除了对胶原特殊氨基酸的再吸收，来源于胶原水解物的多肽按其原有的分子量分布也同样会被再吸收。因此，胶原水解物通过其特异且合适的氨基酸构型和原有的多肽结构，能刺激软骨细胞代谢以及随后新胶原的合成。经研究粗略估计，6H内大约9O的口服胶原水解物就将被肠胃通道再吸收。口服仅LH后，47的水解物就已经被吸收了而单个脯氨酸则达到55。对放射性标记的胶原水解物的探究已经表明，在软骨组织中，其富集程度是在其它组织中的三倍。从另一种角度来看，在整个生物体中除了软骨组织外，用放射性标记的胶原水解物也显示出了同样的分布和同等水平的脯氨酸血浆含量。在96H后，无放射性标记的物质才能在血浆和软骨组织中被检测出来。这些物质在软骨组织中的富集程度和较长时间的存在，证明了软骨和这些蛋白质构成要素之间有特殊的亲和力及相互的代谢影响。如果只有来自胶原构成要素的粘合性或暂时作用，那就无法解释这些物质显著的富集效应和较长时间的存在。4软骨对胶原水解物的选择性作用上文已提到，与胶原的特殊亲和力以及对软骨细胞合成的刺激作用已经被实验所证实。在软骨细胞的培养中，胶原水解物使型胶原的代谢与合成都得到了提高；提高的幅度与剂量有关。在服用胶原水解物后，作为软骨基质的组分之一，软骨所特有的蛋白聚糖的合成也会显著增加。特别是能被清晰测量到的型胶原和产生于软骨中的蛋白聚糖含量的增加，证实了胶原水解物有一种特殊的代谢增强效应和随后对软骨细胞的同化作用，并且诱发了软骨中的修复过程。5耐受力由于胶原水解物是一种食物而非药物，所以不必考虑其有毒的可能性。但是，既然胶原水解物是经过修饰的天然产物，那终究还必须回答关于其耐受力和可能存在的副作用的问题。尽管此类物质已经被批准作为食品添加剂和药用，如作为药物中的赋形剂，但其副作用还不得而知。后来，美国联邦药物管理局FDA进行了关于胶原产品明胶和胶原水解物安全性的研究，并把它们列入安全性最高的一类G普遍公认安全。FDA在2001年L2月21日的一封信中系统阐述了“依照17035条款，委员们提出建议，确定了明胶作为直接食品成分的G地位”。因此，对胶原水解物产品进行了分类，并把它与必需氨基酸列为同一级别。在一系列的可控比较研究中，对胶原水解物的耐受性进行了评定，结果发现其耐受性极好。在对580只老鼠的早期研究中，连续3个星期给每只每天服用15G胶原水解物都没有发现任何副作用。在从全球随机选取的病例研究中发现，连续6个月给389个病人每人每天特意服用10G胶原水解物或安慰剂，而仅有12人约3因副作用腹腔积水和腹泻而中途退出。这L2人中，9人来自安慰剂组3人来自服用胶原水解物的实验组。动物实验已经表明，就算过多口服明胶产品也没有出现令人担心的问题。在对老鼠的调查研究中，【J为10GKG，这个量相当于给人服用约700G胶原水解物。有记录显示在老鼠的食物中加入60的胶原会导致其肝肾重量的增加。然而，这并不是胶原应用所独有的特点。当高于常量的其它蛋白质被摄人L62明胶科学与技术20L0年9月并在肠内吸收后，这些器官的重量也会增加。对于全食物组分，无论是原生的还是经过改性的，若长期服用是否会促进癌症的发生将是人们高度关切的问题。不言而喻。用胶原水解物对这个问题的研究已经实施了。致癌可能性CARCINOGENICPOTENTIA1的评估试验是这样进行的5种取自酵母菌属的鼠伤寒沙门菌、一种酵母菌和中国仓鼠的骨髓细胞，都以AMES试验程序进行。结果没有任何迹象表明，胶原水解物会增加生物体诱变或癌变的可能性。而在致畸性方面即使无相关的研究，也没有发现令人担心的迹象。考虑到胶原的普遍存在，严格地谈论所有动物来源的食物和长期接触服用的日常常规食品之间的关系，这种研究看来并不会有什么相关性。6无过敏危险与所有蛋白质一样，在胶原及其提取物中同样存在着发生致敏和过敏反应的主要可能性。事实上对流量易位而言，当胶原用作静脉注射时，可以观察到个别过敏反应。如果胶原被用于整形外科中的皱纹皮下注射，建议先进行过敏测试。然而这仅适用于有创性应用。至今还没有关于因口服而造成大量对胃肠道过度刺激的报道。不管是从它的蛋白结构，还是长期频繁接触服用的富含胶原的食物，甚至是从跟踪小分子蛋白穿过肠道内腔进入血液的过程来看，口服胶原水解物似乎是不致敏的。而且，也没有发现与食物非配伍INCOMPATIBILITY的非致敏现象。7相互作用一般来说，相比于药物、赋形剂和其它食物组分，胶原水解物的特点在于它最高的安全性。实际上，这是一个由美国食品药物管理局FDA选定的无设限课题SUBJECTTONOLIMITATIONSORRESTRICTIONSO从已发表的论文来看，给动物静脉注射局外的胶原水解物可能会影响血浆纤维连结蛋白的含量。与此相关的是，受试老鼠的伤口愈合被扰乱了。在这样的一种使用情况在任何情况下都是非典型性的情况下，所涉及的危险程度DEGREEOFRISK会进一步被下面的发现所降低。这个发现表明假若注射一种与明胶一样较低分子量的胶原溶液尿素交联明胶，血浆中的纤连蛋白含量和伤口愈合都不受影响。尿素交联明胶的分子量约为40KD。为了让静脉和外肠胃皮下注射不对纤连蛋白造成危险影响，26KD的胶原水解物的分子量被降低了LO倍。纤连蛋白是结缔组织中的一种胞外基质结构蛋白STRUCTURALPROTEINSINTHEEXTRACELLULARMATRIX。作为正常结缔组织中细胞表面及周边环境的组成成分之一，它不断被纤维原细胞合成。其正常功能是，作为结构和粘连蛋白结合到其它一些大分子如胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、氨基葡萄聚糖、肌动蛋白、一些细菌和细胞膜等上去，并帮助纤维原细胞等驻留在伤口上。要是没有与低分子量物质结合，那将导致由胶原水解物引起的胶原细胞含量无法降低。8对软骨细胞代谢的影响如上文所述，已经证实了口服胶原水解物中氨基酸的再吸收。适量供应具有明显较高的甘氨酸、脯氨酸和羟基脯氨酸含量的胶原水解物，可以为软骨细胞的刺激和型胶原合成的增强提供合理解释。因为对于新形成的组织而言，平衡的底物就其它组分的特殊分布来讲只能在胶原中被找到，而在其它营养蛋白里是找不到的。同时，羟基脯氨酸来源于脯氨酸，又对胶原的选择性合成至关重要；羟基脯氨酸的高含量只能在胶原水解物中被检测出来，而不能在其它别的食物中。为确认在实验中所观察到的现象，胃肠病学家做了许多再吸收方面的实验，观察到来自肠道的大分子指明胶一释注，甚至胶囊元件拟指囊体和囊帽释注，都通过吸收作用被生命体全部摄取，并且随后可在血液或尿中第3O卷第3期肖文君胶原水解物及其生物学价值163检测到它们的存在。研究还证实了来自肠道的大分子的透壁吸收；蛋白水解酶进入到构成要素部位，在没有断裂的情况下也能发生再吸收作用。因此。如果在一段时间内胶原水解物能被再吸收并富集于软骨，那可以令人非常信服地认为，这种水解蛋白将直接影响软骨细胞的代谢。所以原则上讲，这对于评估胶原水解物对软骨代谢的影响和对软骨退化可能的抑制作用，都具有重要意义。基于此，进行了软骨早期细胞培养的研究。胞外软骨基质的合成、构建、稳定、养护，及保持同化与异化重构之间的平衡都是由软骨细胞来承担的。软骨必要的基质构成要素为蛋白聚糖和胶原。作为关节软骨所特有的型胶原，通过其三维原纤维网络为维持软骨图3型胶原分泌量与时间的关系在用基本培养基BM培养的牛软骨细胞和添加了OS,ML胶原水解物CH的培养基中。型胶原在它们上清液中的分泌量与时间的关系。数据显示的是4种软骨细胞制品在三次相同试验中所测得的平均值。P001与空白肘照组相比。由于病理的级联作用CASCADE而产生了一些疑问通过对软骨代谢的靶向影响TARGETEDINFLUENCE，是否能够防止关节炎早期阶段的组织弹性提供了必要的稳定性和坚固性而蛋白聚糖则提供了软骨组织的弹性。同时实验还证实了，尽管在软骨细胞生理学方面还有许多不能解释的问题；这些问题涉及特殊的生物活性信号对软骨细胞活性及其合成分解过程的调节。显然，这种在软骨基质中的转化容易受到病理生理学上的影响。研究工作者还发现。在息关节炎的联动过程中，软骨细胞对各种调节信号的敏感性减弱了这将对软骨基质的组成造成影响。他们假设。软骨组织退化和再生以及同化与异化过程之间的差异，会造成型胶原含量的下降。这种主要的生化结构失衡是由通常被视为关节软骨退化标志的病理性改变造成的。反过来。关节软骨厚度及均一性的降低将导致其活动能力的恶化并可能造成关节疼痛。图4N型胶原分泌置与CH的关系添加了胶原水解物后。在牛软骨细胞培养基11天上清液中年测得的型胶原分泌量。数据显示的是6种软骨细胞制品在两次相同试验中所测得的平均值。PO01与空白对照组相比。PO01与加入0ILLCH的小组相比。某些变化，并支撑初期的某些修复过程。在这种情况下，靶组织可能是软骨细胞而不是软骨基质。软骨细胞代谢影响着基质的组成，这可L64明胶科学与技术2OLO年9月通过刺激软骨细胞代谢而不仅仅是主导同化作用来实现。这种系统有两种调节方式。细胞活素和生长激素都能刺激软骨基质分子的生物合成；而反过来，也能提高像胶原酶和蛋白聚糖酶这一类蛋白水解酶的产量。但用这种方法会使分解代谢略占优势。在实际应用中，已经发现了胶原碎片特别是胶原水解物对软骨细胞代谢、组成和功能的影响。为使这些与实际相关的研究结果更加严谨，更清楚地了解其特殊功能；而使用了牛早期软骨细胞培养物来进行研究，以便确定各图5型胶原分泌量舔加了下列其中一种物质后。在牛软骨细胞培养基11天中所测得的型胶原的生物合成量COLI天然I型胶原；PLA小麦蛋白中的游离型胶原；CH胶原水懈物；CHFI胶原水解物组分；CH型胶原水解物；BM对照组的细胞在基本培养基中培养。数据显示的是6种软骨细胞制品在两次相同试验中所测得的平均值。P001与空白对照组相比。结果显示，添加05MGML胶原水解物能型号的水解胶原是否和能在多大程度上刺激软骨细胞，并增加胶原与蛋白聚糖的合成。在一项研究中，使用变性失活的胶原I、型胶原水解物和I、型天然胶原，并以分子量约15KD不含胶原的小麦水解蛋白作为参照，加人C标记的脯氨酸，两天后用液体闪烁计测定其放射性。靶物质是型胶原和蛋白聚糖，它们的放射性检测提供了以下信息相对于不含胶原的小麦蛋白来说，各种胶原产品都具有激励软骨细胞的能力。图6软骨细胞的示踪放射性胶原生物合成的刺激作用添加下列其中一种物质OSMGML后在牛软骨细胞培养基11天中加入14CL一脯氨酸并保温48H然后测定其放射性。COLI；天然I型胶原；COL；天然型胶原；PLA小麦蛋白中的游离型胶原；CH胶原水解物；CHF1胶原水解物组分；CHIT型胶原水解物；BM对照组的细