龟皮胶原蛋白的提取及结构表征（Ⅰ）VIP

第32卷第4期2010年12月湖北大学学报自然科学版JOURNALOFHUBEIUNIVERSITYNATURALSCIENCEVOL_32NO4DEC，2010文章编号10002375201004043404龟皮胶原蛋白的提取及结构表征I黄文，印大中。，朱泽瑞1湖南第一师范学院数理系，湖南长沙410002；2湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410081摘要采用酶法从乌龟皮中提取胶原蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE方法检测龟皮胶原蛋白多肽产品分子量的分布，并将龟皮胶原蛋白和I型胶原蛋白样品进行液相色谱分析HPLC，比较其氨基酸成分和含量SDSPAGE电泳结果分析表明龟皮胶原为I型胶原蛋白，分子量约为288KU龟皮胶原蛋白中，甘氨酸的含量最高，占总量的2469；其次是谷氨酸、精氨酸和丙氨酸，分别为995、808和931；天冬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸等含量在558128之间；组氨酸和蛋氨酸的含量最低，仅占079和009由于龟皮胶原蛋白的含量高于I型胶原蛋白，且与I型胶原蛋白的氨基酸含量差异显著，因此，龟皮胶原蛋白可以作为一种重要的皮胶原进行开发和利用关键词龟皮；胶原蛋白；SDSPAGE；氨基酸中图分类号Q95文献标志码A胶原是生物体内的一种纤维蛋白，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，占人体或其他动物体总蛋白含量的2533L1来源于动物皮的胶原一般统称为皮胶原，其主要组成为工型胶原和型胶原，它们都属于成纤维胶原成纤维胶原因其化学组成、交联和螺旋结构的特点而具有较强的机械性能、低免疫原性、较好的生物相容性和可生物降解性等生物学特性，因而广泛应用于生物、医药、食品及材料等领域L_2人们对于猪皮或牛皮等哺乳动物胶原的研究比较充分，而水产、两栖、爬行等其他动物皮中的胶原蛋白的研究和开发较少随着养殖业的发展及中药材龟板的取用，将会产生大量的龟皮，但对龟皮的研究非常有限本研究就乌龟胶原蛋白的提取、胶原蛋白分子量测定以及氨基酸成分分析做了一些分析，为开发和利用龟皮胶原蛋白提供科学依据1材料与仪器11主要原料乌龟湖南四进生物开发股份有限公司提供，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂，透析袋14000KU，胃蛋白酶、I型标准胶原蛋白、高分子标准蛋白均购自美国SIGMA公司，氯化钠，氢氧化钠，丙酮，冰醋酸，盐酸等试剂均为分析纯12仪器和设备DYY一10型ECP3000三恒电泳仪，DYCZ22A型垂直平板电泳槽，524型恒温磁力搅拌器，IC_6A型日本岛津高效液相色谱仪，凯氏定氮仪，D37520OSTERODE超速冷冻离心机德国2方法与步骤21胶原蛋白的提取211预处理将乌龟处死去头，锯开两边的骨桥，剔除龟肉，取龟的四肢及头部、尾部的皮肤，洗净将洗净的龟皮切成5MMX5MM的小块，丙酮脱脂10H，风干，贮存于4下备用212胶原蛋白的酶解本实验采用胃蛋白酶酶解法，胃蛋白酶可以在胶原链的非螺旋区的特定位点打断胶原肽健，最大程度地保持了其天然结构，适合用作生物医用材料将预处理后的龟皮1G，用双收稿日期2OLO一0427作者简介黄文1967一，女，硕士，副教授，EMAILHWX24703YAHOOCOITLCN436湖北大学学报自然科学版第32卷32龟皮胶原蛋白与I型胶原标准蛋白的氨基酸成分分析行液相色谱分析，得结果如表2从表2的相关系数比较可以看出龟皮胶原蛋白与I型胶原标准蛋白的氨基酸成分呈高度正相关，进一步说明龟皮胶原蛋白为I型胶原蛋白15种氨基酸含量比较发现龟皮中有甘氨酸GLY、丙氨酸ALA、赖氨酸LYS、苏氨酸THR、酪氨酸TYR5种氨基酸含量高于I型胶原标准蛋白，其余LO种氨基酸含量低于工型胶原标准蛋白龟皮与工型胶原标准蛋白的氨基酸含量的方差分析表明见表3FF1MM。，即P001，胶原蛋白中15种氨基酸之间的含量差异达到极显著水平F一3374，由于龟皮胶原蛋白的含量高于I型胶原蛋白，且与工型胶原蛋白的氨基酸含量差异显著，因此，龟皮胶原蛋白可以作为一种重要的皮胶原进行开发和利用进一步将龟皮胶原蛋白氨基酸含量进行多重比较表4表明15种氨基酸中甘氨酸的含量最高，与其它14种氨基酸的含量差异极显著；其次是谷氨酸，它与精氨酸、丙氨酸差异不显著，与天冬氨酸差异显著，与其它氨基酸差异极显著；再其次是精氨酸，它与丙氨酸、天冬氨酸和赖氨酸差异不显著，将龟皮胶原蛋白和工型胶原蛋白样品进表2龟皮胶原蛋白与I型胶原蛋白的氨基酸成分分析MG100MG与丝氨酸、苏氨酸差异显著，与其它氨基酸差异极显著；而丙氨酸和天冬氨酸除了与酪氨酸、组氨酸和蛋氨酸差异显著外，与赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨、亮氨酸、异亮氨、缬氨酸的差异不显著由此看来，胶原中15种氨基酸可归纳为四类第1类为高含量氨基酸1种，即甘氨酸GLY；第类为次高含量氨基酸3种，即谷氨酸GLU、表3I型与龟皮胶原蛋白氨基酸含量的方差分析精氨酸ARG和丙氨酸ALA；第类为一般含量氨基酸9种，即天冬氨酸ASP、赖氨酸LYS、丝氨酸SER、苏氨酸THR、亮氨酸IEU、苯丙氨酸PHE、异亮氨酸ILE、缬氨酸VA1、酪氨酸TYR；第类为微量氨基酸2种，即组氨酸HIS和蛋氨酸MET表4龟皮胶原中L5种氨基酸含量的多重比较平均METTYR、HISVALILEPHELEUTHRSERLYSASPALAARGGLUGLY24692532245723482340232623202255220621021951191616881499GLU9951033”958849841“827821756707603446188189ARG808844769660652638632”567518414257228ALA981616541432424410404339290186029ASP55858751240339538L375310261157LYS441430355Z46238224Z18L_531O4SER324326251142L_3412O114049THR29927720209308507L065LEL1286212137028020006PHE1942O6131022014ILE137192117008VA1186184109TVR128075HIS07919OMET009第4期黄文等龟皮胶原蛋白的提取及结构表征I4结论1龟皮胶原蛋白SDSPAGE电泳结果分析表明，龟皮胶原为I型胶原蛋白酶解后3条肽链分化成5条，表明龟皮胶原蛋白的3条肽链中仅有两个断点，测得各肽链的分子量约为80621、66405、63117、41690、36276KU，龟皮胶原蛋白的分子量约为288KU2三种胶原蛋白的氨基酸含量比较表明龟皮与I型胶原的相关系数为09971，这说明龟皮胶原蛋白极相似于工型胶原蛋白目前的研究工作已知人类的I型胶原是大直径交叉条状纤维的分子聚集体，A链位于第17号染色体，遗传编码区长达4392个核苷酸，编码产物由1464个氨基酸组成，含有51个外显子链位于7号染色体，遗传编码区长达4098个核苷酸，编码产物由1366个氨基酸组成，含有52个外显子从进化的角度看，I型胶原属比较原始的胶原，龟皮胶原与它相似，反映了乌龟物种的原始性3龟皮胶原中15种氨基酸比较发现，龟皮中有甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸5种氨基酸含量高于I型胶原标准蛋白丙氨酸作为糖异生途径的前体物既可作为生物能量的物质基础，又可以别构抑制丙酮酸激酶的活性，给予生物合成前体过剩的信号丙氨酸含量高，预示着乌龟肝脏中谷丙转氨酶的活性强，可使乌龟体内维持较高的氮水平，以达到高能储蓄和低能消耗的目的酪氨酸在一系列酶的作用下可转变为乙酰COA乙酰COA是生物代谓F的能量载体，说明乌龟形成能量载体的原料充足，这对乌龟能量的储存十分有利参考文献1LEECH，ANUJS，LEEYBIOMEDICALAPPLICATIONSOFCOLLAGENLJINTERJOFPHARMA，2001，226122E2王娜，林炜，穆畅道皮胶原的结构、性质与提取方法IJ皮革科学与工程，2006，16242473刘苏锐，王坤余，琚海燕猪皮I型胶原蛋白的提取及其结构表征_J中国皮革，2007，36743494李贺，刘白玲，陈华林，等酶法提取猪皮胶原及结构表征J中国皮革，2002，312314165肖世维，但年华，曾睿，等从动物皮中提取胶原蛋白的方法LJ西部皮革，2009，31151721E6张达江，王亮I型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景【J生物技术通讯，2006，1792265269EXTRACTIONANDCHARACTERIZATI0N0FCOLLAGENFROMTURTLESKINHUANGWEN。YINDAZHONG，ZHUZERUI1DEPARTMENTOFSCIENCE，HUNANFIRSTNORMALUNIVERSITY，CHANGSHA410002，CHINA；2COLLEGEOFBIOTECHNOLOGY，HUNANNORMALUNIVERSITY，CHANGSHA410081，CHINAABSTRACTUSINGEMZYMICMETHODTODISTILLTHETURTLESKINCOLLAGENSFROMTURTLESSKIN；USINGPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESISSDSPAGETODETECTTHEDISTRIBUTINGOFTHEMOLECULARMASS；USINGHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYHPLCTOANALYSETHESAMPLESOFTHETURTLESKINCOLLAGENSANDTYPEICOLLAGENSANDCOMPARETHEIRAMINOACIDCOMPONETSANDCONTENTSTHECOLLAGENOFTURTLESKINWASEXTRACTEDANDSTUDIEDAFTERPEPSINDIGESTIONTHERESULTOFTHESDPAGESHOWEDTHATTHEEXTRACTIONPRODUCTWASTYPEICOLLAGEN，ANDITSMOLECULEMASSWASABOUT288KUTHECOMPOSITIONSOFTURTLESKINCOLLAGENISSIMILARTOTHECOMPONENTSOFTYPEICOLLAGENSINTHESE15KINDSOFANALYZEDAMINOACIDS，THEGLYWASTHEHIGHESTCONTENT，OCCUPYING2469OFTHEAMOUNTTHEGLU，ARGANDALAWASABOUT995，808AND931RESPECTIVELYTHECONTENTOFOTHERAMINOACIDSRANGINGFROMTYRTOASPWASBETWEEN558128THEHISANDMETWERETHELOWESTCONTENT，MERELY