酶法制取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽的工艺

基础研究食品研究与开发F0ODRESEARCHANDDEVELOPMENT2011年4月第32卷第4期39酶法制取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽的工艺宋芹，颜军L，郭晓强，姚倩。郁小兵，1成都大学生物产业学院，四川成都610106；2日本高研株式会社研究所，东京1150051摘要利用酶工程技术，以罗非鱼鱼鳞为研究对象，研究开发罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽制品。以蛋白酶种类、底物浓度、酶解时间、加酶量、温度、PH为实验因素，以胶原蛋白的提取率、分子量等为指标，确定酶解最佳条件为在PH6，温度50，底物浓度150DE，加酶量1MGIHHM的条件下，水解12H，可得胶原提取率为55，平均分子量为920U左右。关键词罗非鱼鱼鳞；复合酶；水解；胶原蛋白寡肽STUDYONEXTRACIONTECHNOLOGYOFTILAPIAFISHSCALECOLLAGENOLIGOPEPTIDESONGQIN，YANJUN，GUOXIAOQIANG，YAOQIAN，YUXIAOBINS21COLLEGEOFFACULTYOFBIOTECHNOLOGYINDUSTRY，CHENGDUUNIVERSITY，CHENGDU610106，SIEHUAN，CHINA；2KOKENBIOSCIENCEINSTITUTE，TOKYO1150051，JAPANABSTRACTTHECOLLAGENPEPTIDFROMTILAPIAFISHSCALEHASBEENEXTRACTEDBYUSINGPEPSINMETHODTHEEFFECTSOFSIXFACTORSINCLUDINGENZYMATICSPECIES，ENZYMECONCENTRATION，SUBSTRATECONCENTRATION，HYDROLYZINGTIME，TEMPERATUREANDPHTHEBESTENZYMATICHYDROLYSISCONDITIONWASDETERMINEDBASEDONEXTRACTIONRATIOANDAVERAGEMOLECULARWEIGHTOFPEPTIDTHEOPTIMUMCONDITIONOFENZYMATICSPECIES，ENZYMECONCENTRATION，SUBSTRATECONCENTRATION，HYDROLYZINGTIME，TEMPERATUREANDPHFORTHECOLLAGENPEPTIDAS1MGIHHM，150GL，12H，50，PH6THEEXTRACTIONRATIOIS55ANDAVERAGEMOLECULARWEIGHTOFPEPTIDIS920UBYTHISPEPSINMETHODKEYWORDSTILAPIAFISHSCALE；COMPOUNDENZYME；HYDROLYSIS；COLLAGENOLIGOPEPTIDE作者简介宋芹1982一，女汉，讲师，博士，研究方向天然产物研究与开发。通信作者郁小兵1959一，男汉，教授，博士，日本文部省特别研究员。【6】章继华，何勇进甲鱼系列产品综合生产工艺J农牧产品开发，1999226277王璋食品酶学MI北京中国轻工业出版社，19988】徐怀德，殷金莲，陈沁甲鱼酶解产物抗氧化功能的研究J中国食品学报，2007，742531【99张树正酶制剂工业【ML】北京科学出版社，1984【1O马丽娜鸡胚多肽的提取及初步分离纯化研究D山东农业大学。2007234511】王朝旭，赵丹，王晓雪酶法酶解骨蛋白最佳条件的研究J食品科学，20012484912】ETSTVIERK，TENSADLERNISSENENEYMEHYDROLYSISOFFOODPROTEIN【N1NEWYORKAPPLIEDSECIENCEPUBLISHER，198413】WILLIAMJLAHL，STEVENDBRAUMENZYMATICPRODCTIONOFPROTEINHUDROLYSATESFORFOODUSEJFOODTECHNOLOGY，19941687114】杨德试验设计与分析M北京中国农业出版社，200223915殷金莲甲鱼多肽提取分离及功能特性研究【D】西北农林科技大学200716】曹文红，章超桦食品蛋白降血压肽及其酶法制备J食品科技，2002491O171OKAMOTOHANAGATAKAWABURAY，ETA1ANTIHYPERTENSIVESUBSTANCESINFERMENTEDSOYBEAN，NATTOJPLANTFOODSHUMNUTR，1995，47394718】MAENOM，YAMAMOTON，TAKANOLETA1IDENTIFICATIONOFANANTIHYPERTENSIVEPEPTIDEFROMCASEINHYDROLYSATEPRODUCEDBYPROTEINASEFROMLACTOBACILLUSHELVETICASCP790JJDAIRYSEI，1996,7913161321【19】SUETSUNAK，UKEDAHISOLATIONOFOCTAPEPTIDEWHICHPOSSESSESACTIVEOXYGENSCAVENGINGACTIVITYFROMPEPTICDIGESTOFSARDINEMUSCALJNIPPONSUISANGAKKAISH，2000，656109610992O】徐怀德，殷金莲，冯丽丹，等甲鱼蛋白酶解产物体外ACE抑制和抗氧化活性研究J】中国食品学报，2008，82586421】盛家荣，陈金浩，孙小兵，等均匀设计优选双酶法分步水解甲鱼蛋白质最佳条件J】_化工技术与开发，2008，377912收稿日期201008一O140宋芹，等酶法制取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽的工艺基础研究胶原蛋白具有美容、抗骨质疏松、降血压、抗氧化等多种生物活性，被广泛地应用于医药、化妆品、保健品等高附加值领域。研究表明，胶原蛋白能改善皮肤的弹性和柔软度，具有帮助皮肤保湿的作用，对皮肤刺激、紫外线照射引起的皮肤疾患有良好的改善作用_1。胶原蛋白还能有效增加骨密度、增强骨强度41。利用先进的现代生物技术，从水产废弃物中提取胶原多肽，生产具有各种生理功能的活性肽，不仅能促进水产业的发展，还可提高人们医疗健康水平。如何从胶原中提取活性肽，已是这一领域的研究热点。罗非鱼属于广盐性鱼类，海淡水中均可养殖，它耐低氧，易于养殖，已被视为传统鱼类的替代品种，正日渐受到欧、美、日市场的青睐，罗非鱼也因此而成为世界性的主要养殖鱼类51。随着罗非鱼养殖的扩大，加工中产生的废弃物也逐年上升。据统计，2007年，我国罗非鱼养殖产量达121万T，占全球的55_句。因此，对水产废弃物进行开发利用，使其变废为宝，既可以带来良好的经济、社会效益，也能促进环境保护。为了确保多肽对人体的安全性和有效性，一般采用酶解法进行活性肽的提取。影响酶解效果的因素主要有酶的种类、加酶量、酶解温度、酶解时间、PH及底物浓度料水比等。本试验将首次从以上几个方面研究罗非鱼鱼鳞中胶原寡肽的酶解方法，提取低分子活性肽，使罗非鱼资源得以合理开发利用，提高其加工的综合效益及经济附加值。1材料、试剂与仪器罗非鱼干燥鱼鳞海南水产品市场；蛋白酶MG日本天野工、R厶株式会社；复合蛋白酶HHM胶原蛋白复合酶日本高研株式会社主席研究员郁小兵博士提供；蛋白酶F3GET本天野工F厶株式会社；蛋白酶FGF日本天野工2,F厶株式会社；胞嘧啶核苷CYTIDINE和光纯药工业株式会社LOTTCH3764；细胞色素CCYTOCHROMEC和光纯药工业株式会社LOTPKN7103；VITAMINB和光纯药工业株式会社LOTALC1200；酪蛋白和光纯药工业株式会社LOTWAG7059；三氯乙酸关东化学株式会社LOT701S1207；K2HPO和光纯药工业株式会社LOTWDM3773；KHZPO4和光纯药工业株式会社LOTDWK6099；羟脯氨酸，氯胺T，柠檬酸，氢氧化钠，醋酸钠，正丙醇，对二甲氨基苯甲高氯酸，异丙醇，硫酸等试剂，均为分析纯。LC一9ASHIMADZUCR7A高效液相色谱仪日本岛津公司；UV一1601型紫外分光光度计日本岛津公司；METRLERAEIO0型电子天平瑞士METFLER公司。2提取操作步骤1预处理将洗净干燥后的鱼鳞适当粉碎，称取20G，加入200ML蒸馏水，再往溶液中滴加6MOLLHC1，检测溶液PH，直到PH不再变化为止PH2，约消耗6MOLLHC120ML，浸泡2H后，弃去溶液，用水冲洗。往样品中加人适量蒸馏水，密封，121OC，20RAIN湿热灭菌。2酶解在一定温度、PH等条件下，采用蛋白质分解酶对鱼鳞胶原蛋白寡肽进行提取。3灭活将样品于80下，15MIN灭活。4减压抽滤当样品温度降至室温，进行减压抽滤，滤纸孔径约50TXM。5冷冻干燥于一40冷冻样品后，冻干室减压至50PA，加热板温度50QC，12H，冷冻干燥。所得粉末为胶原蛋白短肽。3胶原蛋白提取率的测定胶原蛋白含量以羟脯氨酸的含量换算，胶原蛋白含量等于羟脯氨酸含量乘以系数111通过氨基酸成分分析得出，羟脯氨酸含量为占总氨酸含量的9左右。羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特性蛋白质，通过0、125、25、50、100IXGML5种不同浓度的羟脯氨酸标准样品经氧化脱羧反应生成吡咯，以对二甲氨基苯甲醛显色，测定558NM处的吸光度，以浓度IXGML为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线，得回归方程为Y0014LX00041，R0999。结果表明，羟脯氨酸含量在0100GML之间与吸光度呈良好的线性关系。按以下公式计算胶原蛋白提取率。胶原纯度111MLM2XL00式中M为测定的羟脯氨酸质量，G；M为测定时称取的样品质量，G。胶原蛋白提取率胶原纯度XMM2XL00式中为成品的质量，G；为鱼鳞的质量，G。4凝胶柱色谱法测定平均分子量在色谱柱SUPERDEXPEPTIDE10300GL、柱温25、流速05MUMIN、进样量50L、以002MOLLPHOSPHATEBUFFER，025MOLLNAC1，PH72为流动相的色谱条件下，在214NN波长处测定样品或标准品细胞色素CCYTOCHROMEC，025MGML，VB12VITAMINB12，0025MGML，胞嘧啶核苷CYTIDINE，0025MGML的保留时间，以各标准品峰的保留时间MIN为横坐标，分子量的对数1OGMR为纵坐标，绘制标准工作曲线，得线性回归方程一00743X56301，RO998。按以基础研究宋芹，等酶法制取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽的工艺下公式计算平均分子量。平均分子量的计算MR1XA1MR2XA2MR3XA3十MRXA式中RN为色谱图中第N个峰的分子量，U；A为色谱图中第N个峰占总峰面积的百分数，。5结果51酶的种类选择比较了蛋白酶MG米曲霉ASPERGILLUSORYZAE菌株、复合蛋白酶HHM、蛋白酶F3G根霉RHIZOPUSNIVEUS菌株、蛋白酶FGF枯草芽孢杆菌BCSUBTILIS以及MG和HHM的混合酶对鱼鳞胶原蛋白的水解情况。按说明书，分别以各酶的最佳酶解条件，复合酶采用取两种酶的平均酶解参数，对预处理后的罗非鱼鱼鳞进行酶解，按2项下操作步骤对样品进行灭活、减压过滤、冷冻干燥。计算各条件下胶原蛋白的提取率及平均分子量，结果见表1。表1各种酶的水解效果比较TABLE1COMPARISONOFTHEHYDROLYSISEFFECTOFVARIOUSENZYMES酶解酶的用量底物平均酶的种类温度，PH时间酶与底物浓度提取分子酶的种类皿，曼P时间酶与底物浓度分子OCH的质量比GL率量，U蛋白酶MG50451221504121737复合酶HHM55701221504320602蛋白酶F3G407012，21503923891蛋白酶FGF601001221503724836MGHHM50601211150559173由以上实验结果可知，利用复合酶MGHHM水解，在相同的时间内提取率最高，且平均分子量较小，能得到较多10个氨基酸以下的寡肽1个氨基酸的分子量约为100，故采用MG米曲霉ASPERGILLUSORYZAE菌株和复合蛋白酶HHM进行酶解。52温度的影响按照底物质量浓度150G，L，加酶量1MGIHHM，PH6的条件，分别在40、45、50、55、60对罗非鱼鱼鳞进行水解，反应12H后，按2项下操作步骤对样品进行灭活、减压过滤、冷冻干燥。测定胶原蛋白提取率和平均分子量。结果见图1、2。6O554O353O温度图1温度对胶原蛋白提取率的影响FIG1THEEFFECTSOFTEMPERATUREONEXTRACTIONRATIOOFPEPTID16001400生120010001800413035404550556065温度图2温度对胶原蛋白平均分子量的影响FIG2THEEFFECTSOFTEMPERATUREONAVERAGEMOLECULAR由以上实验结果可知，温度对鱼鳞水解反应影响较大。在4550时水解度随着温度升高不断增大，当温度高于50时水解度开始下降。这是因为温度对酶解反应速度具有双重影响，升高温度可加快酶解反应速度，同时当温度过高时，酶容易变性，酶活力容易降低。由图1、2可知在温度50时，胶原蛋白的提取率最高、平均分子量最低，故采用温度为50进行酶解。53底物浓度的影响在PH6，温度50，加酶量1MGIHHM的条件下，分别以底物浓度50、100、150、200GL进行水解，反应12H后，按2项下操作步骤对样品进行灭活、减压过滤、冷冻干燥。计算胶原蛋白提取率和平均分子量。结果见图3、4。6O50褂4O30O501OO150200250底物浓度GL图3底物浓度对胶原蛋白提取率的影响FIG3THEEFFECTSOFSUBSTRATECONCENTRATIONONEXTRACTIONRATIOOFPEPTID1200删1000800600050100150200250底物浓度GIN图4底物浓度对胶原蛋白平均分子量的影响FIG4THEEFFECTSOFSUBSTRATECONCENTRATIONONAVERAGEMOLECULARWEIGHTOFPEPTID由以上实验结果可知，在底物质量浓度为50G，L一150GL时提取率随底物质量浓度的增加而增大。这是因为酶解反应最终达到一个动态平衡，在底物质量浓度较低时，根据酶反应动力学，反应速度随底物质量浓度的增加而增大，使反应平衡向产物方向移动，所以提取率的增加也较快。但是当底物质量浓度进一步增大，酶的活性中心逐渐被底物所饱和时，增加底物质量浓度提取率也不会增加，反而影响反应速度，使提取率降_2宋芹，等酶法制取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽的工艺基础研究低。所以当底物质量浓度超过150L时提取率开始下降。由图可知，当底物质量浓度在100GL200L范围内时，提取率较大。同时对胶原蛋白短肽的平均分子量并没有太大的影响。故采用底物浓度150GL进行酶解。5_4加酶量的影响在PH6，温度50CC，底物浓度150GL的条件下，分别以加比例的复合酶进行水解，反应12H后，按3项下操作步骤对样品进行灭活、减压过滤、冷冻干燥。计算胶原蛋白提取率和平均分子量。结果见图5、6。6050釜40300L23456样品号图5加酶量对胶原蛋白提取率的影响FIG5THEEFFECTSOFENZYMESDOSAGEONEXTRACTIONRATIOOFPEPTID删岛霜样品号图6加酶量对胶原蛋白平均分子量的影响FIG6THEEFFECTSOFENZYMESDOSAGEOILAVERAGEMOLECULARWEIGHTOFPEPTID注1MGHHM02O8；2MGHHM05O53MGHHM0802；4MGHHM11；5MGHHM22。由以上实验结果可知，加酶量1MGIHHM或2MG2HHM时水解产物中胶原的含量最高。在加酶量超过1MGIHHM后，提取率的增加变得缓慢。这是因为当酶的浓度相对于底物浓度较低的情况下，加大酶的用量可以有效加快酶解反应速度，但当酶的浓度相对于底物浓度较高情况下，反应速率开始由底物浓度控制，所以继续增加酶的用量对提取率影响较小，考虑到生产成本，选择加酶量为1MGLHHM。55PH的影响在温度50，底物浓度150G，I，加酶量1MG1HHM的条件下，分别以PH50、55、60、65、70，进行水解，反应12H后，按2中3操作步骤对样品进行灭活、减压过滤、冷冻干燥。计算胶原蛋白提取率和平均分子量。结果见图7、8。由以上实验结果可知，当PH为6时，提取率最高，平均分子量最小，说明复合酶的活性和稳定性与谆PH图7PH对胶原蛋白提取率的影响FIG7THEEFFECTSOFPHOILEXTRACTIONRATIOOFPEPTID160014002001000霸80060040020040455055606570PIT图8PH对胶原蛋白平均分子量的影响FIG8THEEFFECTSOFPHONAVERAGEMOLECULARWEIGHTOFPEPTIDPH密切相关，因此选择酶解PH为6。56时间的影响在PH6，温度50CI二，底物浓度150，加酶量LMGIHHM的条件下，进行水解，分别反应2、4、8、12、16H后，按3项下操作步骤对样品进行灭活、减压过滤、冷冻干燥。计算胶原蛋白提取率和平均分子量。结果见图9、10。时间H图9反应时间对胶原蛋白提取率的影响FIG9THEEFFECTSOFREACTIONTIMEONEXTRACTIONRATIOOFPEPTID霜1；卜时间L图L0反应时间对胶原蛋白平均分子量的影响FIG10THEEFFECTSOFREACTIONTIMEOILAVERAGEMOLECULARWEIGHTOFPEPTID基础研究宋芹，等酶法制取罗非鱼鱼鳞胶原蛋白寡肽的工艺由以上试验结果可知，复合酶在反应初期04H内，活性较高，提取率增大较快，产物平均分子量的变化也最快，在反应进行12H后，达到顶峰，此时，水解物平均分子量在10001,1以内，考虑到成本以及反应时间过长会导致杂菌繁殖，故确定反应时间为12H。6结论通过对各酶解条件的水解产物胶原蛋白的提取蚕寸墨J。F占总峰面积5081822343261L_3L6510022429628049630951243一率、平均分子量的考察，最终确定从罗非鱼鱼鳞中提取胶原蛋白的最佳条件为在PH6，温度50，底物浓度150GL，加酶量1MGIHHM的条件下，水解12H。在此条件下，提取率能达到55左右，平均分子量约为920U，10个氨基酸以下的寡肽占较大比重，见图11。蛋白质水解物的生产方式分为化学降解法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质。化学法簧主譬8呈璺蓦皇量垂量曼宾霸2D赛童詈薹里专晕墓奏霎菱耋量萎善霎蚕萋垂孽萎霎量N甘N卜舌AVERAGEMR9172783图L1样品GPC色谱图FIG11GPCCHR