《聚合酶链反应》PPT课件

第七章聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR),DNA的复制(replication)由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。,一、PCR的基本原理,母代DNA,子代DNA,基本原理：,在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。,基本步骤：变性：加热使双链DNA变为单链退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应,一、PCR的基本原理示意图,二、PCR引物设计PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。PCR反应中有两条引物，即5引物和3引物。设计引物时，通常以信息链为基准，5引物与位于待扩增片段5上游的一小段DNA序列相同，以信息链的互补链为模板，引导信息链的合成，3引物与扩增片段3端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成。PCR反应扩增的就是这一对引物之间的DNA片段。,（一）PCR引物设计原则1、引物长度一般为1530个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74,亦会影响产物的生成，且合成引物的成本增加。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在4555%左右。设计引物时要考虑3端和5端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54C3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。,5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。7、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。,（二）引物设计的方法现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，(在线引物设计的网站有：http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3www.cgi;/cgi-bin/SGD/web-primer;http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;/urolab/methprimer/index1.html;/rawprimer.html)得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最为优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。,三、模板制备PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。大多数用途的PCR反应中，对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不严。大量的实验数据表明存在一定量的蛋白质，或SDS等对实验过程影响不大，所以只要没有交叉污染，模板DNA的制备可以不必像克隆、酶切、连接、标记等反应所用DNA制备那样严格。其次，模板用量很低，理论上102104拷贝的模板是可满足各种要求的PCR反应。由于种种原因，准备的模板量要求达一定水平。一方面可减少由于实验操作和实验精确度方面等原因而引起的扩增失败，同时用作扩增的模板DNA量越多，由于交叉污染引起的反应失败的可能性小。,（一）DNA模板制备去垢剂破坏细胞，除杂质，乙醇沉淀核酸水煮沸溶解细胞要求并不严格模板用量低，哺乳动物基因组DNA1g，质粒DNA0.1ng,(二)RNA模板的制备RNA提取试剂盒酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法异硫胍氯化铯密度梯度分离法SDS-酚-氯仿法注意防止RNA水解,（三）模板的取材病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等法医学标本：血斑、精斑、毛发考古标本,四、PCR基本反应（一）以DNA为模板的反应反应体积：50100l缓冲液引物底物：4种dNTP模板：102105拷贝TaqDNA聚合酶矿物油其中模板DNA的用量必须根据其分子量的大小加以调整。,（二）以mRNA为模板的反应以mRNA为原始模板进行的PCR反应称为逆转录PCR一）逆转录反应体系体积：20l缓冲液底物：4种dNTP引物：oligo(dT)1218模板：RNA逆转录酶其他试剂：RNA酶抑制剂，MgCl2.DTT.牛血清白蛋白二）PCR反应体系同以DNA模板的反应体系,（三）PCR产物的积累规律,在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。,PCR产物的积累规律示意图,五、PCR反应条件的控制,(一)标准PCR反应流程1.反应体系：标准PCR反应体积为50100l,其中含有缓冲液，4种底物，引物，DNA模板和耐热DNA聚合酶。2.反应步骤：加入各种试剂，950C热变性510分钟，使模板DNA充分变性，同时除去蛋白酶，氯仿对耐热DNA聚合酶的影响。然后加入2UTaqDNA聚合酶，加50l液体石蜡封盖反应体系，防止液体挥发。进行PCR反应。但PE9700仪设计了热盖，不需加液体石蜡。,(二)循环参数数变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94，1min；95，30s；97，15s；退火温度和时间：4555，30s1min延伸温度和时间：72，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；34kb,34min循环次数：2530次，视最初靶分子浓度而定两步PCR：将退火和延伸温度合并为一个温度，采用二温式两步PCR,(三)PCR反应成分1.PCR反应的缓冲液：1050mmol/LTris-Cl缓冲液，72时pH7.2,调节反应体系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。,2.镁离子浓度：1.5mmol/LTaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响TaqDNA聚合酶的活性。常用1.5mmol/L。,3.底物浓度：20200mol/LdNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.07.5，分装小管，于-20存放，过多冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTPs浓度在20200mol/L,dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。,4.耐热DNA聚合酶：2.55u在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。,（1）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在7580具有最高的聚合酶活性。7580每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55时为22个核苷酸/秒；37和22时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。,TaqDNA聚合酶没有35外切酶活性。没有校正功能的。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%0.25%。TaqDNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和PfuDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3-OH端。但对4种dNTP聚合到3-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特性，在构建T载体时，在反应体系中只加一种底物，即只加dTTP。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直接用来克隆PCR产物。,（2）TthDNA聚合酶,在950C半衰期为20分钟，具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。但不具35外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为1/500,（3）VentDNA聚合酶,该酶在1000C时半衰期达95分钟，97.50C时半衰期长达130分钟，其扩增产物的长度可达1013kb。VentDNA聚合酶具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000，忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。,（4）PfuDNA聚合酶,此酶耐热性极好，在97.50C半衰期大于3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比TaqDNA聚合酶高12倍。,4.引物：0.10.5mol/LPCR反应引物浓度为0.10.5mol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。,5.模板,在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或102105拷贝的待扩增片段作为模板,6.其他因素,1）热启动：提高扩增的特异性2）添加剂：消除引物与模板的二级结构，降低DNA的解链温度，增进DNA复性时的特异配对，增加或改进DNA聚合酶的稳定性，可添加一些添加剂。3）液体石蜡：防止反应液蒸发后引起的冷却与反应成分的改变。,六、PCR实验中应注意的事项,由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品的污染便有可能导致假阳性结果的出现。（一）PCR实验室的设置样品制备区：这个区域专门用于制备模板，要求：PCR产物和带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个区域操作，用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。在提取DNA样品和RNA样品时要带手套，并要经常更换。纯化样品对污染的风险有极大的影响。,PCR操作区：PCR仪应单独放在另一间实验室。另外，在PCR反应前应对准备和保持干净的PCR成分给予高度重视。所用的所有溶液应该没有核酸和核酸酶；所用PCR试剂中的水都是高质量的新鲜蒸馏水；所用试剂都应大体积配制，分装保存（一次用量）；所用吸头和试管均为一次性并是灭菌过的。所用器皿和塑料制品都要严格消毒。,反应产物分析区：在这区域中所用的试剂，一次性器材和仪器都必须专门用于PCR产物的分析，绝对不能把这一区域的试剂或仪器用于样品的制备，PCR反应前的操作。,（二）设置严格对照阳性对照：阳性DNA模板阴性对照：阴性DNA模板试剂对照：无DNA模板,（三）阴性结果应采取的措施用第一次扩增的产物作模板进行第二次扩增增加TaqDNA聚合酶的浓度增加模板量纯化模板增加扩增循环次数适当降低退火温度,（四）出现非特异性产物时应采取的措施增加退火温度减少TaqDNA聚合酶的浓度减少退火及延伸时间减少引物浓度减少扩增循环次数,七、PCR相关技术的发展,PCR技术建立以来，因其较高的实用性而在各个领域广泛使用。PCR方法本身又在使用中不断得到发展，形成了一系列适用不同目的的特殊方法。,设计一对外测引物和一对内测引物先用外测引物扩增含目的DNA的大片段再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段,1、巢式PCR和半巢式PCR(nestedprimerPCR),2、共享引物PCR（sharedprimerPCR）利用3条引物来扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物可与两种DNA序列互补结合,共享引物PCR示意图,3、多重PCR(multiplePCR)用多对引物扩增同一模板的几个区域,4、不对称PCR(asymmetricPCR)采用不同的引物浓度扩增得到单链DNA两引物浓度比为50100：1,5、锚定PCR（anchoredPCR)以mRNA为模板经RT合成cDNA，末端转移酶在cDNA3末端加上poly(dG)尾。Poly(dC)锚定引物与poly（dG)尾互补结合引导合成未知DNA序列,6、反向PCR（invertedPCR)用限制酶消化基因组DNA，用连接酶将各片段连接成环状。用限制酶切割已知序列，根据已知序列设计3端引物和5端引物，扩增未知序列。,7、彩色PCR（colorcomplementationasay)用不同荧光染料分别标记PCR引物，采用多重PCR扩增同一DNA的不同区域，显示不同颜色，用于基因诊断。,8、原位PCR（insituPCR）固定组织细胞内的DNA或RNA，以其为模板进行PCR反应的过程,将原位杂交的细胞定位技术和PCR的高灵敏度相结合，产生了原位PCR技术。其原理是以组织固定处理细胞内的核酸或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。与其它PCR方法不同的是，原位PCR不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。如冷冻的组织或经有机试剂固定的组织细胞，用蛋白酶，DNA酶处理，进行原位的逆转录，再加入PCR扩增试剂，进行原位PCR反应。用于检测靶基因的细胞定位、组织分布及靶基因的表达等。,9、定量PCR（quantifiedPCR）以mRNA为模板合成cDNA加入参照基因，待测基因，参照引物，待测基因引物PCR扩增以参照基因的扩增产物的量为基础，观测待测基因产物的相对量。进行定量PCR时，要考虑内参照因素、RNA制备、逆转录PCR、凝胶电泳、定量检测各个环节对结果的影响。,10、差异显示PCR（differentialdisplayPCR）将两种mRNA逆转录为cDNA第一链加入锚定引物，随机引物PCR扩增，以扩增产物代表相应mRNA分析两种细胞基因表达的差异,11、重组PCR（recombinantPCR）PCR参与的体外基因突变或基因融合过程,12、荧光实时定量PCR技术,荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近才出现的一种PCR检测方法，是基于荧光能量转移(FRET)的原理建立的。FRET是指通过供受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，使受体发光。检测方法有双链DNA内插染料、水解探针检测模式、分子信标技术等多种。,在普通PCR仪的基础上再配备一个激发和检测的装置。通过PCR反应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。该法具有高特异性和可靠性，实验结果稳定，重复性好，在临床检测方面有广泛的用途，如对病毒、病菌和其他病源微生物致病基因的检测。,13.增敏PCR,当模板数小于1000个拷贝时，采用增敏PCR，可明显提高PCR的产量。分两期进行，第一期是在引物与模板均少的状态下进行，延长退火时间，进行1520个循环。这一期扩增的主要目的是增加模板量，有效地防止第二期扩增时加入过多引无间的相互反应，阻止引物二聚体的形成。第二期反应：补加引物至0.1mol/L,于常规条件下进行20个PCR循环。第一期增加特异性，第二期增加特异产物的量。,14.表达PCR,表达PCR是重组PCR的一种，通过将高表达的启动子和高效转录的终止子附加与扩增目的基因的两个引物的5端，使目的基因的5端带上强的启动子，3端带上高效转录终止序列，将其克隆到表达载体上可获得高效表达。亦可直接进行转录和翻译。例如：将PCR引物的5端带上启动子3端的同源序列，扩增的目的基因的产物与启动子混合进行第二次PCR扩增，经变性，退火，其中有一种产物可作为PCR反应的模板，加入适当的引物，可产生带有启动子序列目的DNA片段，即可直接进行转录和翻译。,八、PCR产物的检测,（一）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭(EB)染色，在紫外灯下便可以直接确定DNA片段在凝胶板中的位置。其分辨率很高，可测出1ngDNA。首先根据PCR扩增片段的大小选择琼脂糖凝胶浓度，一般800bp以上的片段用0.8%的胶，800bp以下的片段用1.0%2.0%的胶。成功的PCR扩增应可见到分子质量均一的一条区带，对照分子质量标准还可对扩增产物进行半定量。,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高，主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基因片段，因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。PAGE有静电效应和分子筛效应，分辨率很高，在DNA序列分析时，即使相差一个核苷酸片段也能很好地分开。适用于PCR扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度，电泳后可用银染或溴乙锭染色检测，银染比EB染色检测灵敏度高210倍。,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳,高效液相色谱(HPLC)是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术，其特点是分离速度快、效果好，是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。离子交换层析的基础是溶质分子所携带的电荷，而合成的基因片段恰好具有这一性质。因此，ICE分析广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化。,（三）层析技术,为了确定PCR产物是否是预先设计的目的片段，或产物是否有突变，都需做分子杂交检测。分子杂交包括点杂交和Southern印迹杂交。点杂交灵敏度较高，特别适用于特异性不高的PCR扩增产物分析。Southern印迹杂交可鉴定PCR产物的大小和特异性，检测灵敏度可达10ng。基本过程是PCR产物进行常规的琼脂糖凝胶电泳，然后，印迹转移到尼龙膜上，再用标记的探针进行杂交检测。,（四）分子杂交,若知道PCR扩增片段的序列或限制性内切酶酶切图谱，则可选择合适的限制酶消化PCR产物，再进行电泳分析，根据PCR酶切产物的电泳图谱，可判定PCR产物的特异性及是否存在突变