【国家标准】DB51T 868-2009 马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯A病毒检验鉴定技术规程（DTS）

19 8682009马铃薯卷叶病毒、马铃薯 Y 病毒和 马铃薯 A 病毒检验鉴定技术规程 2009布 2009施四川省质量技术监督局发布 8682009 I 目 次 前言 . 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 原理 . 1 5 试剂与材料 . . 2 6 仪器及用具 . . 3 7 田间调查及取样 . . 3 8 实验室检验 . . 4 9 结果判定 . . 4 10 除害处理 . . 5 附录 A （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒 验程序 . 6 附录 B （规范性附录） 马铃薯 Y 病毒 验程序 . 7 附录 C （资料性附录） 马铃薯 A 病毒 验程序 . 8 附录 D （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒 检验程序 . 9 附录 E （规范性附录） 马铃薯 Y 病毒 检验程序 . 11 附录 F （规范性附录） 马铃薯 A 病毒 检验程序 . 13 附录 G （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒、马铃薯 Y 病毒和马铃薯 A 病毒为害症状. 15 8682009 前 言 本标准附录A 、附录B 、附录C 、附录D 、附录规范性附件，附录G 为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站、四川出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：宁红、郭迪金、张洪峰、孟兴、谢成伦、黄玲、熊玉兰。 8682009 1 马铃薯卷叶病毒、马铃薯 Y 病毒和 马铃薯 A 病毒检验鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y 病毒和马铃薯A 病毒的实验室检验、检测和鉴定技术要求。 本标准适用于马铃薯块茎、种苗和其它茄科植物感染马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y 病毒和马铃薯 测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 003 马铃薯种薯产地检疫规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 马铃薯卷叶病毒 称属黄症病毒科，马铃薯卷叶病毒属。病毒粒体呈球状，直径 25 等轴对称病毒，致死温度70 ，稀释限点约10起马铃薯卷叶病。 马铃薯Y 病毒 简称属马铃薯Y 病毒科，马铃薯Y 病毒属。病毒粒体呈弯曲长杆状，为单链毒，长730 死温度52 62 ，稀释限点为100起马铃薯重花叶病，是引起马铃薯退化的主要病毒。 马铃薯A 病毒 简称属马铃薯Y 病毒科，马铃薯Y 病毒属。病毒粒体呈弯曲长杆状，为单链毒，长730 致死温度44 52 ，00起马铃薯轻花叶病。 标条带 据某种病毒列中一段保守的、特异的碱基序列设计特异引物，通过到的与引物设计长度吻合的标条带的存在，是判断某种病毒存在的标准。 4 原理 马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y 病毒和马铃薯 距离传播主要通过人为的引种、商品流通等，带毒块茎和种苗是该病毒传播的主要载体，采用免疫学和分子生物学方法，对病毒载体进行检验，并根据有关判断标准进行马铃薯卷叶病毒、马铃薯 毒检验鉴定。 8682009 2 5 试剂与材料 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 验试剂 捉抗体（ 捉抗体：即 疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 备用。 捉抗体：即 疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 备用。 捉抗体：即 疫球蛋白，按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 备用。 标抗体（ 标抗体：由碱性磷酸酶标记的 免疫球蛋白抗体。 标抗体：由鼠抗 探测抗体和碱性磷酸酶标记的兔抗鼠的 疫球蛋白组成。 标抗体：由鼠抗 探测抗体和碱性磷酸酶标记的兔抗鼠的 疫球蛋白组成。 被缓冲液（取 g 碳酸氢钠（ g 碳酸钠（0.2 g 叠氮化钠（，用 1 000 馏水溶解，并调 到 藏于 4 备用。 涤液(取 g 磷酸氢二钠（0.2 g 氯化钾（、0.2 g 无水磷酸二氢钾（8 g 氯化钠（ 0.5 g 吐温20，用 1 000 馏水溶解，并调整 到 品提取液（：取 1.3 g 硫酸钠（20.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（400）、0.2 g 叠氮化钠（2.0 g 鸡蛋清白蛋白粉、 20.0 g 吐温20，用 1 000 涤液溶解，并调整 到 藏于 4 备用。 标抗体稀释缓冲液 0.2 g 牛血清白蛋白、 2.0 g 聚乙烯吡咯烷酮（400）、g 叠氮化钠（ 100 涤液溶解，并调整 到 藏于 4备用。 脱脂奶粉 0.4 g 用 100 涤缓冲液溶解，并调整 到 藏于 4备用。 标抗体溶液 标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液 市售产品要求稀释 标抗体，贮藏于 4 备用。 标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液 市售产品要求稀释 标抗体，贮藏于 4 备用。 标抗体溶液：用酶标抗体稀释缓冲液 市售产品要求稀释 标抗体，贮藏于 4 备用。 物缓冲液（用 80 菌蒸馏水将 g 氯化镁（ 、g 叠氮化钠（ 9.7 乙醇胺（解后，调 到 容到 100 藏于 4备用。 物溶液（：将 5 硝基苯磷酸钠（解于 5 物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前 10 ，避光条件下制备。 止液：12 g 氢氧化钠（ 于 100 馏水。 验试剂 洛尼鼠白血病病毒反转录酶（ 100 u/L 。 冲液：40 20 冰醋酸调 冲液：50 H=100 .1 10 0 % 甘油（ 0冲液：100 ，500 抑制剂（10 u/L 。 8682009 3 T 增强剂（ 水乙醇（ L 裂解液（ 蛋白液（。 （2.5 u/L 。 0 洗液（。 蒸水（ 酚蓝（ 氮（ 物 (游引物（：5 ，游引物（: 5。用双蒸水稀释至 20M。 游引物（： 5 游引物（ : 5。用双蒸水稀释至 20M。 游引物（： 5 游引物（ : 5。用双蒸水稀释至 20 M。 100 NA 1 500 脂糖凝胶：称取 1.5 g 琼脂糖缓缓倒入 250 角瓶内，加入 100 微波炉中加热 1 解后，再加入 5 L 物染料，倒入调平并安放适当梳齿的制胶板上，冷凝后小心拔出梳齿。 6 仪器及用具 联反应板：根据样品数量选用 40 孔和 96 孔两种规格。 量可调进样器： 2 L 10 L、 10 L50 L 、 10 L200 L 、 200 L1 000 L 和 1 平：1/100 g ，1/1 000 g 。 温培养箱：5 50 。 联免疫检测仪。 式高速离心机。 增仪。 平电泳仪。 胶成像系统。 应管（）。 钵：内径为 60 0 箱：冷藏 2 8 ，冷冻 。 滤柱：过滤柱 吸附柱 旋混匀器。 7 田间调查及取样 间调查 8682009 4 在马铃薯现蕾期、盛花期、枯黄期前2 周进行田间症状观察，发现病毒症状植株，可进行取样送检。对各级种薯生产基地，按2003 种薯繁殖期间实施产地检疫，当发现疑似症状时取样送实验室鉴定。三种病毒为害症状参见附录G 。 害植株取样 在马铃薯生长期若发现马铃薯病毒病症状，可整株取样送检，并保证送到时样品新鲜；也可采取疑似样品叶片和新梢等病变部位，在冷藏条件下送检，保证送到时样品新鲜。 毒种薯生产基地取样 各级脱毒马铃薯种薯繁育基地在种薯收获前1 个月左右进行病毒检测。取样时若发现疑似病毒症状的植株，直接采取疑似症状的马铃薯植株送检；若田间植株无病毒症状，则按表1 数量随机抽样送检，表1 脱毒马铃薯种薯病毒检测取样数量 种薯类别 面积 样数量 （个） 备注 1050 2 50100 3 100500 6 5001 000 10 1 0002 000 15 原原种 2000 20 原种 1000 2 每5株为1个样，不同品种分别计算。 8 实验室检验 验 铃薯卷叶病毒 验程序 见附录 A，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 铃薯 Y 病毒 验程序 见附录 B，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 铃薯 A 病毒 验序 见附录 C，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 验 铃薯卷叶病毒 检验程序 见附录 D，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 铃薯 Y 病毒 检验程序 见附录 E，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 铃薯 A 病毒 检验程序 见附录 F，如采用认可的试剂盒，按说明操作。 9 结果判定 目测观察 在阴性对照不显色，且阳性对照显黄色的前提下，样品反应孔黄色为阳性，即判定样品带相应的被检病毒；样品反应孔无颜色变化为阴性，即判定样品不带相应的被检病毒。 酶联检测仪测定光密度值（ ） 在阴性对照孔的性对照孔品反应孔的2 倍，为阳性反应，即判定样品带相应的被检病毒；否则为阴性，即判定样品不带相应的被检病毒。 阴性对照无扩增条带，且阳性对照出现目标条带的前提下，样品样品为阳性，即判定样品带相应的被检病毒；样品样品为阴性，即判定样品不带相应的被检病毒。 8682009 5 10 除害处理 检验过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后须进行消毒和除害处理；经检疫鉴定后的样品，应在存三个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后，需进行灭活处理。 8682009 6 附 录 A （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒 验程序 被抗体 被 向酶联反应板每孔加入100 L 用包被缓冲液稀释的捉抗体，将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育4 h 或4冰箱过夜。 板 向每个反应孔中加入200 L 洗涤液，迅速倒出，重复2 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 样 品制备 将待测样品剪碎，取0.3 入1 品提取液充分研磨后，再加入2 品提取液充分研磨至均匀。剩余样品于冰箱保存备查，在制样时应注意防止样品的交叉污染。 样 用微量进样器将制备好的样品加入酶联反应板孔内，每个样品三次重复，每孔100 L 。设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育2 h 或4冰箱过夜。 板 向每个反应孔加满洗涤液，迅速倒出，再加满洗涤液，静置3 复3 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 合酶标抗体 酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L 标抗体溶液。置于保湿容器中室温孵育2 h。 板 色 每孔加入100 L 底物溶液。25避光孵育30 60 至阳性对照显色。 止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。 果记录 测观察 反应孔显现颜色的深浅与病毒的浓度呈正比。反应孔无颜色变化为阴性，记录为“ ” ；反应孔黄色为阳性反应，记录为“ ”，依色泽的逐渐加深记录为“ ” 和“ ” 。 酶联检测仪测定光密度值 当阴性对照孔的光密度值样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2 倍，即判定为阳性反应，记录为“ ” ，否则记录为“ ”。 8682009 7 附 录 B （规范性附录） 马铃薯 Y 病毒 验程序 被抗体 被 向酶联反应板每孔加入100 L 用包被缓冲液稀释的捉抗体，将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育4 h 或4冰箱过夜。 板 向每个反应孔中加入200 L 洗涤液，迅速倒出，重复2 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 样 品制备 将待测样品剪碎，取0.3 g 于研钵中，加入1 品提取液充分研磨后，再加入2 品提取液充分研磨至均匀。剩余样品于冰箱保存备查，在制样时应注意防止样品的交叉污染。 样 用微量进样器将制备好的样品加入酶联反应板孔内，每个样品三次重复，每孔100 L 。设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育2 h 或4冰箱过夜。 板 向每个反应孔加满洗涤液，迅速倒出，再加满洗涤液，静置3 复3 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 合酶标抗体 酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L 标抗体溶液。置于保湿容器中室温孵育2 h。 板 色 每孔加入100 L 底物溶液。25避光孵育30 60 至阳性对照显色。 止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。 果记录 测观察 反应孔显现颜色的深浅与病毒的浓度呈正比。反应孔无颜色变化为阴性，记录为“ ” ；反应孔黄色为阳性反应，记录为“ ”，依色泽的逐渐加深记录为“ ” 和“ ” 。 酶联检测仪测定光密度值 当阴性对照孔的光密度值样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2 倍，即判定为阳性反应，记录为“ ” ，否则记录为“ ”。 8682009 8 附 录 C （资料性附录） 马铃薯 A 病毒 验程序 被抗体 被 向酶联反应板每孔加入100 L 用包被缓冲液稀释的捉抗体，将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育4 h 或4冰箱过夜。 板 向每个反应孔中加入200 L 洗涤液，迅速倒出，重复2 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 样 品制备 将待测样品剪碎，取0.3 入1 品提取液充分研磨后，再加入2 品提取液充分研磨至均匀。剩余样品于冰箱保存备查，在制样时应注意防止样品的交叉污染。 样 用微量进样器将制备好的样品加入酶联反应板孔内，每个样品三次重复，每孔100 L 。设置阳性对照、马铃薯健康组织研磨液阴性对照和包被缓冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，室温孵育2 h 或4冰箱过夜。 板 向每个反应孔加满洗涤液，迅速倒出，再加满洗涤液，静置3 复3 次。洗板完成后将酶联反应板倒置于吸水纸上，吸干反应孔中残留液体。 合酶标抗体 酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L 标抗体溶液。置于保湿容器中室温孵育2 h。 板 色 每孔加入100 L 底物溶液。25避光孵育30 60 至阳性对照显色。 止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。 果记录 测观察 反应孔显现颜色的深浅与病毒的浓度呈正比。反应孔无颜色变化为阴性，记录为“ ” ；反应孔黄色为阳性反应，记录为“ ”，依色泽的逐渐加深记录为“ ” 和“ ” 。 酶联检测仪测定光密度值 当阴性对照孔的光密度值样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2 倍，即判定为阳性反应，记录为“ ” ，否则记录为“ ”。 8682009 9 附 录 D （规范性附录） 马铃薯卷叶病毒 检验程序 板 用剂盒（给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品），称取50 00 块需经发芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5 中，加入500 L 的解液（使用前按解液1 入2- 巯基乙醇10 L ），涡旋剧烈震荡5 其混匀。将匀浆液转移至过滤柱， 12 000 心2 心吸取上清液至无（ 离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱，12 000 心1 弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱00 12 000 心1 弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱L 漂洗液 12 000 废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12 000 心2 去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的心管中，向膜中央加入50 L 100 L 无的双蒸水，室温放置2 12 000 到液。 反转录 应体系 表 转录反应体系 反应物 模板T x RT 入量 （ L） 1 转录程序 反转录程序为：42 ， 50 4 ，5 保存。 应体系 表 应体系 反应物 10入量 （ L） 1 4 4 应程序 反应程序为： 94 3 94 30 59 30 72 30 30次循环； 72 10 4 保存。 增产物检测 8682009 10 脂糖凝胶电泳 将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5 L 心点入样孔内。电泳缓冲液100 V ，电泳30 果观察和记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察带有无和片段大小。 测样品有与阳性对照相同的特征带为阳性反应，记为“ ” ，无相同特征带的为阴性反应，记为“ ” 。凝胶成像系统成像并拍摄凝胶图片。 8682009 11 附 录 E （规范性附录） 马铃薯 Y 病毒 检验程序 板 用剂盒（给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品）， 称取50 00 块需经发芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5 中，加入500 L 的用前按解液1 入2- 巯基乙醇10 L ），涡旋剧烈震荡5 其混匀。将匀浆液转移至过滤柱， 12 000 心2 小心吸取上清液至无（ 离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱2 000 心 1 掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱加入700 L 去蛋白液12 000 心1 弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱L 漂洗液 12 000 废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12 000 心2 ，去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的心管中，向膜中央加入50 L 100 L 无的双蒸水，室温放置2 12 000 到液。 反转录 应体系 表 反转录反应体系 反应物 模板T x RT 入量 （ L） 1 转录程序 反转录程序为：42 ， 50 4 ，5 保存。 应体系 表 应体系 反应物 10入量 （L ） 1 4 4 应程序 反应程序为： 94 3 94 30 59 30 72 30 30次循环； 72 10 4 保存。 增产物检测 8682009 12 脂糖凝胶电泳 将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5 L 心点入样孔内。电泳缓冲液100 V ，电泳30 果观察和记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察 性对照目标条带为 400 检测样品有与阳性对照相同的特征带为阳性反应，记为“ ”，无相同特征带的为阴性反应，记为“ ”。凝胶成像系统成像并拍摄凝胶图片。 8682009 13 附 录 F （规范性附录） 马铃薯 A 病毒 检验程序 板 用剂盒（给出该试剂盒信息是为了方便标准使用者，如果等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品）， 称取50 00 块需经发芽后切取幼芽），在液氮中迅速研磨成粉末状，转移粉末至预冷的1.5 中，加入500 L 的用前按解液1 入2- 巯基乙醇10 L ），涡旋剧烈震荡5 其混匀。将匀浆液转移至过滤柱， 12 000 心2 小心吸取上清液至无（ 离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱2 000 心 1 掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱加入700 L 去蛋白液12 000 心1 弃废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱L 漂洗液 12 000 废液，将吸附柱放回收集管中，重复漂洗一次。漂洗完后，将吸附柱在12 000 心2 ，去除残余液体，并在室温下放置片刻。将吸附柱放入一个新的心管中，向膜中央加入50 L 100 L 无的双蒸水，室温放置2 12 000 到液。 反转录 应体系 表 转录反应体系 反应物 模板T x RT 入量 （ L） 1 转录程序 反转录程序为：42 ， 50 4 ，5 保存。 应体系 表 应体系 反应物 10入量 （ L） 1 4 4 应程序 反应程序为： 94 3 94 30 59 30 72 30 30次循环； 72 10 4 保存。 增产物检测 8682009 14 脂糖凝胶电泳 将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入水平电泳槽，取5 L 心点入样孔内。电泳缓冲液100 V ，电泳30 果观察和记录 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，放入凝胶成像系统中，观察 性对照片目标条带为300 检测样品有与阳性对照相同的特征带为阳性反应，记为“ ” ，无相同特征带的为阴性反应，记为“ ”。凝胶成像系统成像并拍摄凝胶图片。 8682