分子发光光谱法PPT课件

.第1、5章分子发光光谱法，2，某物质的分子吸收一定的能量后，电子从基态转变为激发态，以光放射的形式从激发态返回基态的现象称为分子发光，基于此确立的分析方法就是分子发光分析法。 分子后退过程中以光辐射的形式释放能量，根据5.1的概要、一、分子发光分析法及其分类、3分子激发时吸收的能量和辐射光的机理， 光致发光：由光源激发而发光化学发光：由化学反应能激发而发光-化学发光分析法电致发光：由电能激发而发光-原子发光分析法生物发光：由生物体放出的能量激发而发光、荧光-荧光分析法磷光分析法、4，2， 分子荧光分析法的特征1 .高灵敏度荧光强度随激发强度的增强而增强(可提高激发强度、提高荧光强度，采用高灵敏度检测系统可大幅度提高灵敏度，检测极限荧光分析法比分光光度法低24位数)。 5、2 .不同于选择不同的物质用不同的光激发，选择不同激发光波长的物质发出的荧光，不同的检测荧光波长容易排除其他物质的干涉，选择性好，实验方法简单， 4 .测量样品量少的仪器价格适中测量范围广的发光强度可以定量测量许多微量的无机物和有机物，广泛应用于生物化学、分子生物学、免疫学和农牧产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用更广泛，分光光度法，6，5.2分子荧光和磷光的基本原理，一是荧光和磷光的发生，激发态分子转变为基态过程中，以光子形式放射多馀能量的现象称为“发光”，激发单重态：分子吸收能量后，转变过程中不发生自旋方向的变化用S0、S1、S2分别表示分子基态、第一和第二激发单重态.7、激发三重态：分子吸收能量后，在过渡过程中伴随着电子自旋方向的变化。 分子的第一和第二激发三重状态分别用T1、T2表示。 8，1 .减振：是指在相同电子能量水平下电子从高振动能量水平转移到低振动能量水平的无辐射转移过程。 2 .内部转换器：通常发生无辐射迂回过程，其中当两个电子能级非常接近并且振动能级相互重叠时，电子从高能级转移到低能级。 3 .系统时段超过在：个不同的复用状态之间的无辐射转变，并且同时伴随着激励电子的自旋状态的改变，例如，s 1到t 1。 4 .外部转化：激发分子通过与溶剂和其他溶质分子的相互作用转化能量，减弱或消除荧光和磷光的强度的过程。 这种现象也称为“熄灭”或“消光”。 9、10、荧光发光：当分子处于单重状态的最低振动能层时，去激发过程在10-710-9s左右的时间内发射光子返回基态。 磷光发光：激发态分子通过系统间跃进激发三重状态后，经过迅速的振荡缓和达到第一激发三重状态(T1)的最低振荡能级，从T1状态分子通过发射元件返回基态。 磷光的寿命比荧光长得多，11，图中容易产生磷荧光激发*荧光n*，12，2，固定激发光谱和发光光谱，改变激发光的波长，由测得的荧光强度与激发光波长的关系得到激发光谱曲线。 选择最大激发波长作为激发光波长，测定在不同发光波长发出的荧光或磷光的强度，得到荧光或磷光光谱曲线。13，14，3，分子荧光参数，1 .量子产率又称荧光效率，物质分子的荧光产率取决于激发态分子活化过程的各相对速度。 荧光寿命是在停止激发之后荧光强度降低到最大强度的1/e所需的时间，并且通常由表示。 I0、It分别表示时间0和t处的荧光强度。 利用荧光寿命，可以对荧光混合物进行分析。、16、物质只吸收紫外可见光，产生*n*迁移，荧光*与n*迁移相比摩尔吸收系数大，寿命短*迁移产生强荧光，在n*迁移产生的荧光弱，但系统间产生跃迁，一般产生更强的磷光，有机芳香族化合物和金属离子络合物是最强的最有用的荧光体，三、 荧光与分子结构关系17、具有共轭系的芳香环或杂环化合物、电子共轭度越大容易产生荧光的环越多则共轭度越大、产生的荧光波长越长则发光荧光强度越强、1、共轭系具有强的荧光、18、芳香族化合物具有共轭的不饱和系， 产生很多荧光多环芳香族烃是重要的环境污染物，用荧光法测定为3， 4-苯并芘是一种强致癌物质，ex=386nmem=430nm，19 2 .刚性平面结构相对稳定的平面结构，大多数具有强荧光的分子具有刚性平面结构，荧光素：氧桥将两环固定在一个平面上，具有平面结构，具有强荧光物质，酚20、例1、2-芪、反式：平面配置强荧光体、顺式：非平面配置非荧光体. 21 3 .金属螯合物的荧光，大部分无机盐类的金属离子不能产生荧光，螯合物能够产生强荧光，能够用于微量金属离子的测定的有机配体是弱的荧光体，或者不产生荧光，但在与Mn形成螯合物后成为平面配置，增强荧光， 产生荧光的例子：8-喹啉醇为弱荧光体，与Mn Al3、Mg2形成螯合物后形成刚性结构，可增强荧光，22、4 .取代基的类型对荧光物质的荧光特性和强度也有很大影响。 (1)增强荧光的取代基为-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等供电子基团的n电子(孤立电子)的电子云与苯环上的轨道平行，共有共轭电子，扩大共轭体系，使荧光波长变长，增强荧光强度的(2)荧光的取代基-COOH、 -COOR、-NO、-SH吸收电子基团，缩短荧光波长，荧光强度变弱，(3)影响不明显的取代基-NH3、-R、-SO3H等(4)芳香环被f、Cl、Br、I取代后，体系间的飞跃变强，磷光变强，荧光变弱。 其荧光强度随卤原子量的增加而减弱，磷光相应增强，此效应为重原子效应。 (5)取代基位置的对准，邻位取代可以增强荧光，并且间位取代可以抑制荧光。24、4、环境对荧光、磷光的影响，1 .溶剂的影响可能在相同的荧光物质不同的溶剂中显示不同的荧光性质，一般来说，溶剂的极性变强，荧光波长变长，荧光强度增大，2 .在温度的影响低温下测定，提高灵敏度是因为辐射迁移的速度几乎不随温度变化大多数荧光物质随着溶液温度的升高，荧光效率降低，荧光强度减弱。 温度对磷光的影响更大，25，3.ph的影响，含酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光特性受溶液ph的影响更大。 共轭酸碱对是具有不同荧光性的两种类型，分别具有荧光效率和荧光波长。 例如：苯酚，离子化后荧光消失，pH1有荧光，pH13没有荧光，26，但两个苯环相连的化合物显示出相反的性质，分子的形状没有荧光，离子化后出现荧光，例如：苯酚，有荧光，没有荧光、27、4 .荧光猝灭(荧光熄灭)、荧光物质分子与溶剂分子和其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。 降低荧光强度的物质称为荧光消光剂，(I )冲击熄灭、冲击熄灭是荧光熄灭的主要原因。 处于激发单重状态的荧光分子M*与灭灯剂q碰撞时，激发态分子在无辐射迁移下返回基态，起到灭灯作用。冲击熄灭随温度的升高而增加；随溶液粘度的降低而增大。28、(ii )能量转移是指处于激发单重状态的荧光分子M*与灭灯剂相互作用后，发生能量转移，激发灭灯剂，其反应如下。 (iii )组合物的熄灭是指在熄灭剂和荧光分子处于基态时发生配合反应，生成不产生荧光的络合物。 29、(iv )自灭火和自吸收荧光物质浓度大时，自灭火现象时常发生，可能是激发态分子间碰撞造成的能量损失。 如果荧光物质的吸收光谱与发光光谱大大重叠，则从荧光物质发出的荧光有一部分可能被自身的基态分子吸收，这一现象被称为自我吸收。 随着荧光物质浓度的增加，自吸收现象加剧。 关于荧光强度与荧光物质浓度的关系，当用强度I0的入射光照射液槽内的荧光物质时会产生荧光，荧光强度If在荧光浓度低(A0.05 )的情况下，荧光物质所产生的荧光强度If与浓度的关系为If=fIa=f(I0-I )， Ia吸收的放射强度I0为入射光强度If=f(I0-I010-A)=fI0(1-10-A )，展开上式，在31、a、0.05的情况下，方括号内的其他项目与第一项相比可以忽略，上式简化了If=2.3fI0a=2.3fi0bc，a 与c有关，对于一定的物质，激发光波长和强度一定时f、I0、b为常数，结合KIf=KCIp=KC进行定量分析的结果是32，荧光强度与物质浓度呈线性关系，If=KC仅在浓度低时使用，荧光物质测定微量或微量成分，灵敏度高。 浓度高时，If和c不是线性关系，有时c变大，If反而降低是由于式的后面的影响，有时会产生荧光消光效果。 荧光分析器主要包括光源、单色器、液晶槽、检测器和显示器，并且与光源、第一单色器、液晶槽、第二单色器、em和光谱仪不同。、i0、5.3荧光和磷光分析器、34、1、光源、激励光源通常要求比吸收测定中的光源更大的放射强度。 应用波长范围宽的荧光光度计中常用的高压水银灯和氙弧灯，利用水银蒸气放电发光的光源经常使用的是365nm、405nm、436nm的3根光谱在365nm的光谱中最强，应用最广泛的光源，发出250800nm强的连续光源、35、2、单色器、多种荧光光度计一般采用两个光栅单色器，分辨率高，可以扫描光谱，得到激发光谱，荧光光谱的第一单色器的作用：分离所需的激发光，选择最佳激发波长ex，进行该激发第二单色器作用：去除杂散光或杂质产生的干扰光，选择测定用的荧光波长em . 用选定的em测量荧光强度，并进行定量分析。36，3，样品池，加入测定溶液，通常是石英材料的方形池，四方通光，只有手拿棱或最上面。 4、检测器将光信号转换成电信号，放大，直接转换成荧光强度的荧光强度一般较弱，对检测器要求高灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。 荧光分析之所以比吸收光度法灵敏度高得多，是因为荧光强度与激发强度成正比，提高激发强度可以大大提高荧光强度。 37、(2)荧光分析装置类似于荧光分析装置。 主要区别如下。 1 .试样室的试样必须在液氮温度(77K，-196)下测定低温磷光(将液罐放入装有液氮的杜瓦瓶中)固体表面的室温磷光分析需要特制试样室。 用机械光切割装置磷光镜区分荧光和磷光。 利用荧光寿命短、磷光寿命长消除荧光干扰。.38、(一)定量分析方法的定量分析是根据If=KCIp=KC1.标准曲线法中最常用的定量分析方法，在与试样相同的条件下处理已知量的标准物质，制备一系列标准液，测定它们的相对发光强度。 以相对荧光强度为纵轴，以标准溶液的浓度为横轴，5.4荧光和磷光分析及其应用，39， 2 .荧光猝灭法用于定量分析荧光猝灭，具有高灵敏度和选择性的荧光物质m和猝灭q不产生荧光的基态络合物MQM Q=MQ (非荧光物质)，与猝灭添加前的荧光强度、猝灭添加后的试验液的荧光强度常数、猝灭浓度、I前/I后的C(Q )具有线性关系40、与标准曲线法类似，在一定浓度的荧光体系中加入各自不同量的猝灭q，制作荧光物质即猝灭体系，在相同条件下测量荧光强度同样的荧光物质CMCMCMCMCM和不同量QCQ0CQ1CQ2CQ3CQx(CQ0=0) 求出IfI前I后1I后2I后3I后x，I前/I后1I前/I后2I前/I后3I前/I后x，41，3 .比较法比较简单，样品数不多则比较法测定的标准溶液浓度为Cs、Cs与未知液浓度Cx接近， 在相同条件下测定的荧光强度未知液Ifx=KCx标准液Ifs=KCs、比较、42、4 .多成分混合物的荧光分析如下： (1)如果2成分的荧光峰不相互干涉，则可以在各自的荧光波长下测定，可以求出它们的含量；(2)如果2成分的荧光峰相互干涉，则可以在激发光谱中测定荧光强度未知液Ifx=KCx标准液Ifs=KCs 可以使用在某个激发光的下一个成分中产生荧光峰、在其他成分中产生荧光峰的不同的激发光进行测定，43，Al3 8-喹啉醇络合物的氯仿溶液ex=365nmem=520nmg3-8-喹啉醇络合物的氯仿溶液ex=436 nmem=436 nmem Al3络合物产生荧光，Ga3络合物不产生荧光，没有荧光峰，产生436nm的激发光，Ga3络合物产生荧光，但Al3络合物不产生荧光，无荧光峰在365nm激发，在520nm激发Al3 8-喹啉醇络合物，在436nm激发， 在520nm下测定Ga3 8-喹啉醇络合物，例如， 44、(3)2成分的荧光光谱与激发光谱干涉时，利用荧光强度的加法性(F=F1 F2 F3 )，以适当的荧光波长进行测量，使用联立方程式，例如：硫胺素荧光CTex=385nmem=435nm吡啶硫胺素荧光CPex=410nmem=480nm， 互相干涉荧光光谱重叠，在385或410nm激发，在435和480nm分别测定荧光强度。 在. 385或410nm处激发，分别在435和480nm处测量荧光强度，if435/385=26339104ct21004cp，if480/385=96965214ct10224cp，if480/410=2816104 CT 1709104 CP if433 410=6419104CT 252104CP、硫胺素浓度、吡啶硫胺素浓度、If=KCK:纯物质在选定波长下测定If，求出k，385nm激发或410nm