生物分离工程 第八章 电泳技术

电泳技术horesis，本章的主要知识点，电泳概念电泳的基本原理电泳技术的分类中常用的凝胶电泳技术是什么？电泳装置的基本组成聚丙烯酰胺凝胶电泳的一般过程，SDS-page电泳的基本原理和工艺琼脂糖电泳的特性及应用等电聚焦电泳的基本原理两相电泳的概念和特性，了解电泳概念、电泳速度和凝胶电泳，以及其他几种常见电泳的原理和特性、操作和应用。电泳概念，ArneTiselius物理化学家，诺贝尔奖获得者定义充电胶体粒子电场移动；电泳决定了围绕每个离子的离子雾的扩散双电层，离子大小越大，溶液中的离子强度越高，电泳现象就越明显。因此电泳现象的表面电位和双电层的因素起着决定性的作用。电泳的简单原理，蛋白质、核酸、多糖等经常作为粒子分散在溶液中，它们的纯电荷取决于介质的h浓度或与其他大分子的相互作用。带电粒子在电场中的移动方式主要取决于分子大小和形状、分子所具有的电荷或分子的生物学和化学特性。斯托克斯定律(f=6rvv)将介质粘度为到半径为r的粒子的移动速度的粒子的有效电荷q和电位梯度e产生的生物聚合物胶体溶液放入无干涉电场中，则斯托克斯定律(f=6 RV v)对介质的摩擦阻力f起作用。但实际上，f取决于凝胶厚度、粒度，甚至介质的内部渗透。电泳迁移率、电泳迁移率：为在电位梯度e影响下的时间t中带电粒子的迁移距离d .该单位不同于cm2sec-1V-1电泳迁移率，为从混合物中分离其他物质提供了基础，电泳的粗略分类根据电泳原理，现有3种形式的电泳分离系统移动接口电泳，带电泳的主要技术，带电泳常用的技术载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳、凝胶电泳、电泳支持介质，不干扰化学惰性、大分子的电泳过程，具有良好的化学稳定性、均匀性凝胶电泳支持介质：聚丙烯酰胺凝胶(PGA)在丙烯酰胺和交联剂N，N-叉双丙烯酰胺的作用下，在引发剂和生长剂的作用下聚合。琼脂糖凝胶：从琼脂中纯化分离的交配多糖的分子结构，大部分由1，3连接-D吡喃半乳糖和1，4连接3，6连接脱水-D吡喃半乳糖交替形成。丙烯酰胺的聚合，丙烯酰胺的聚合通常由化学或光化学过程进行，通常使用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素(引发剂)进行。N，N，N ，N- 4甲基乙二胺(TEMED)作为生长剂。生长的催化体系实质上是自由基催化的氧化还原过程。丙烯酰胺的化学聚合是在碱性条件下生产自由基的单体丙烯酰胺变成自由基状态，经过一系列自由基反应得到的聚合物。影响聚合的主要因素，引发剂和生长剂的浓度：浓度小会降低聚合速度；浓度过高容易成为电泳及电泳带畸变的原因。常规控制确保聚合过程在40-60分钟内完成。系统pH:酸性条件、碱性条件都可以，但是为了获得最佳聚合结果，最佳pH值仍然存在；温度：低温下聚合使凝胶破碎混浊。适当的温度增加会使凝胶透明，有弹性。分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合。吸入系统纯度：金属离子可能影响凝胶聚合。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛效果在利用凝胶介质的电泳中，电泳介质粘度高，摩擦阻力高，不仅可以阻止对流，还可以最小化扩散。凝胶中的大分子分离是根据电荷、大小和形状凝胶分离不同大小分子的这一特性，由于其大小筛选能力，分子筛效应，图中的a、b、c是正离子，琼脂糖凝胶的特性、结构和特征如下。琼脂糖凝胶孔径大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率比凝胶电泳低。高机械强度：可在浓度低于1%的情况下使用。无毒；染色、脱色程序简单，背景色低。热可逆性；生物中性：通常不与生物材料结合。电渗(EEO)大：对流电泳，电泳新介质，N-取代聚丙烯酰胺介质：聚N-acroyl-tris(NAT)gelln-acroyl sugargarsaryy凝胶干燥器：用于电泳和染色后干燥。灌浆模具：粘合剂、玻璃和梳子；电泳转移装置：利用低电压、高电流的直流电场，扫描凝胶电泳分离区或电泳斑点，提供PVDF膜、电泳洗脱装置：回收样品凝胶扫描和摄像装置：扫描电泳带，提供定量结果。垂直电泳槽和灌封模具，电泳一般工艺，现有聚丙烯酰胺凝胶电泳，原理：因为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是多孔介质，不仅可以防止对流，减少扩散；而且其孔径大小与生物大分子相似，能主动参与生物分子分离，具有分子筛效果。因此，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质不仅取决于电泳过程中蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的大小和形态。页面包括：盘电泳、垂直电泳或水平电泳、电泳前准备、缓冲系统选择：保证蛋白质的可溶性、稳定性、生物活性；电泳时间和分辨率：理论上，页面可以在任何PAGE上进行，但实际上可能会发生酸或过碱水解(脱酰胺)。因此，pH必须限制在3到10之间。缓冲界的选择原则是两个标准的对立折衷。缓冲液的pH值选择在远离样品中各种蛋白质的等电点，蛋白质分子带电荷的电荷密度高，电泳时间短，带细，窄；当缓冲pH位于接近分离样本的一个或多个蛋白质的等电点时，蛋白质分子间的电荷密度大不相同，分辨率高。因此，经常选择pH8.09.5的缓冲液。常用缓冲液包括三糖苷(pH8.39.5)、三硼酸(pH8.39.3)和三乙酸(pH7.28.5)，离子强度的选择，离子强度不能太高。这时电导率低，热量低，电泳快。但是不能太低估，也要有缓冲能力，太低的离子强度容易聚集蛋白质。一般选择缓冲液的离子强度在0.010.1mol/L之间，因为凝胶浓度选择是页面电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于分子的大小，形状。因此，凝胶的分子筛效应，即凝胶的孔径，与电泳的分辨率、电泳速度密切相关。根据凝胶孔径和分离分子的大小和形状，不排斥凝胶：浓度为0.71.0%的琼脂糖凝胶；排斥凝胶：浓度超过1%的琼脂糖凝胶和普通页面，凝胶浓度太大，孔径小于样品分子大小，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍保留在样品添加位置；凝胶浓度太小，孔径太大，样品中的各种蛋白质分子与缓冲液一起推进，不易分离；凝胶浓度与分子量测定的关系，页面的特定工作过程，粘合剂：确定凝胶公式(凝胶、引发剂、生长剂浓度和缓冲液)，使用灌封模具灌封；准备样品：选择合适的样品缓冲液，确定合适的样品浓度(12mg/L，染色试验)，添加样品(溴酚蓝)；电泳：46小时，直到溴酚蓝前沿到达阳极底部；检测：紫外线扫描或染色(comas bliant blue R-250，银染色-灵敏度比测试高100倍，荧光探针)；照片，凝胶干：定量测定：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，十二烷基磺酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于蛋白质亚碱分子质量和未知蛋白质分子质量的测定；特点：设备简单，操作方便，测量快，重复性高，无需精炼样品。SDS-PAGE的原理，蛋白质分子的分解聚SDS作为变性剂和有用试剂，打破分子和分子之间的氢键，破坏分子折叠，蛋白质分子的二次，三次结构。强力还原剂，如二硫醇、-巯基乙醇，可以破坏半胱氨酸残基之间的二硫键。因此，如果在样品和凝胶中添加SDS和还原剂，蛋白质分子会分解成构成它们的多肽链，分解后氨基酸侧链和SDS相结合，形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，条带会大大超过蛋白质的原始电荷量，从而消除分子间的电荷差异。此外，蛋白质-SDS聚合物的外观基本相同，因此在电泳过程中消除了分子外观对迁移率的影响。蛋白质样品经过SDS处理后，亚基解聚和分子形状变化，未知蛋白质分子量的测定，根据上述SDS-page原理，我们可以用SDS-page电泳测定未知蛋白质的分子量；作为分子量不同的标准蛋白质，SDS-PAGE电泳获得其他标准蛋白质的电泳迁移率，创建标准校正曲线，然后对未知蛋白质在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测量迁移率，从标准曲线中获得相应的分子量。载体阳性电解质pH梯度等电聚焦，isoelectrofocusing)，IEF使用蛋白质分子或其他阳性分子的等电点，在稳定连续、线性pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。利用等电聚焦技术进行分离，分析的对象仅限于蛋白质和成分者。根据设定PH梯度的原理，斜率分为载体良性电解质梯度和固相梯度。工作原理，蛋白质的等电点蛋白质的最大特征是电荷的动作，在不同的pH环境下具有不同的正电荷或负电荷。但是，在某些pH中，蛋白质的正电荷为零，而这个pH是蛋白质的等电点(isoelectricpointpI)。蛋白质的等电点是物理化学常数，取决于它的氨基酸组成和形态。利用等电点差分离、分析、载体阳性电解质pH梯度等全焦原理，载体阳性电解质pH梯度等全焦等，在支撑介质上添加载体阳性电解质，通过直流电通过，在阳极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度，带电的蛋白质分子进入该系统后，产生运动，聚集在等电点的相同位置。、等电聚焦分离度、一般页面和等电聚焦电泳的差异、载流子良性电解质和pH梯度形成、等电聚焦技术的核心是建立pH梯度载流子性电解质的概念。载体性电解质必须具有以下特征。它必须是性别，在分离柱上也能得到平衡的位置；变性不能用于等电点，只有载体变性，即具有导电性和良好缓冲能力的化合物才能用于等电点。用于等电焦点的主要载体性电解质，AmpHoline(瑞典lkhb公司)由许多脂肪族聚氨基聚羧酸的异构体和同系物组成，它们是连续变化的氨基和羧基非Servalyte(德国Serva公司)产品BiolytePharmalyte(瑞典引入电场后，载体阳性电解质分子移动到阴极或阳极，具有最低等电点的分子(电荷最大负电)移动到正极，速度最快。只有在正电荷达到零的位置时才停止，因为这个位置接近两极，缓冲力高，所以环境溶液的pH等于分子本身的pI。第二，一些低pI载体阳性电解质(含有第二多的负电荷)也向阳极移动，直到正电荷减少到0。同样，周围环境溶液pH值与自身pI相同。所有载体阳性电解质分子以增加pi系列的方法分别在正极和负极之间达到自己的位置，并给出pH梯度。载体阳性电解质在电场中的pH梯度模式，水平等电聚焦电泳，粘合剂：溶液制备(丙烯酰胺，N，N-叉双丙烯酰胺，载体阳性电解质等)，移植；电泳：添加剂可在凝胶上的任何位置使用，浓度一般为0.5 2mg/ml；固定：