生物制药工艺学

.,生物制药工艺学,生物制药工艺学主讲教师：吴梧桐教授,.,生物制药工艺学主要参考书,1吴梧桐主编生物制药工艺学第二版，北京，中国医药科技出版社，2006.2王志军主编生物技术药物研究开发和质量控制，北京，科学出版社，2002.3吴剑波微生物制药，北京，化学出版社，2002.杂志期刊：1.中国抗生素杂志.2.药物生物技术.3.中国生物工程学报.4.中国生化药物杂志.5.中国天然药物.6.中国医药工业.,.,生物制药工艺学Biopharmaceuticalprocess,一、学习本课程的目的：1、培养自己掌握扎实的专业知识，具有创新、创业能力的高素质人才，按联合国科教文组织对世界大学生的要求：（1）Learntoknow.(2)Learntodo.(3)Learntobe.(4)Learntotogether.2、培养自己成为药物研究、生产、流通、应用与管理的专门人才。为人民的防病、治病、保健、康复提供疗效好，副作用少，价格便宜，使用方便的生物药物。,.,二、本课程的性质：是生物技术、生物工程、海洋药学、生化制药、微生物制药、生物技术制药的专业必修课，也是药学专业的重要选修课。三、本课程研究内容是从事各类生物药物的研究，生产和制剂工艺过程的一门综合性应用技术科学。（1）生化与微生物药物制造工艺。（2）生物技术药物与生物制品制造工艺。（3）其它生物医药产品（康复保健品）制造工艺。四、学习任务与要求：（1）掌握制造工艺基本原理及相关基础理论。（2）熟练制造技术过程及制剂技术。（3）熟悉生物药物的来源、结构、性质及临床用途。,.,第一章生物药物概述IntroductionofBiopharmaceutics,1药物Medicine(remedy)药物是用于预防、治疗或诊断疾病与调节机体生理功能、促进康复促健的物质，有4大类：（1）预防药物：如疫苗、卡介苗、艾滋病疫苗、SARS疫苗、肿瘤疫苗。（2）治疗药物：如抗生素、INS、尿激酶。（3）诊断药物：如肝肾功能检查试剂盒、免疫诊断试剂盒。（4）康复保健药物：如维生素、氨基酸、叶酸。,.,2药品Drug直接用于临床的药物制剂产品，是特殊商品。药品特点：有固定组成，明确规定有适应症、用法与用量，疗程，并说明可能存在的毒副反应。还规定使用有效期。药品有3大类：（1）化学药品，（2）生物药品，（3）中药（药材，饮片，中成药）。,.,生物药物Biopharmaceutics,是以生物材料（生物体、生物组织或其成分：组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢物、排泄物）为原料，综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。通常有5类：（1）生化药物Biochemicalmedicine（2）微生物药物Microbialmedicine（3）海洋药物Marinemedicine（4）生物制品Biologics(biologicals)（5）生物医药产品Biologicalmedicinalproducts,.,随着生物技术药物的快速发展，现代生物药物已形成4大类：（1）重组DNA药物（包括基因工程和蛋白质工程药物）（2）基因药物geneticmedicine（核算类药物，以遗传物质DNA、RNA为治疗物质基础的药物），如核算疫苗、反义药物。（3）天然生物药物（4）合成或半合成药物。,.,第一节生物药物的研究与发展前景,一、生物药物研究发展现状生物药物的发展已走过传统生物制药技术和工业化生物制药时代，从1982年10月rhIns上市，正式步入现代生物制药阶段。1、世界现状：已上市200多种生物技术药物，已进入其临床400种；其中200种进入FDA审批，还有700多种进入-期临床，在各个不同临床前研究的有2600多种。,.,二、生物药物的发展与展望,1生物技术药物研究已进入蛋白质工程药物时代第一代重组药物时代：一级结构与功能和天然活性蛋白质完全一样；第二代重组药物时代：对天然产物表达物进行简单修饰，如PEG化或糖基化；第三代重组药物时代：蛋白质工程药物，在DNA水平上，合理设计、改造、创制新型治疗蛋白。目的：（1）提高活性；（2）减少或消除毒副作用；（3）提高体内外稳定性；（4）产生新的功能特性。如：快速Ins，B9-SerB9-Asp,B27-ThrB27-Glu长效Ins,B21-AsnB21-Gly,B-C末端加入2个ArgPI由pH5.4pH6.8,.,2.中国现状：（1）生产生化药物100多种，抗生素近100种；（2）已批准生物技术药物30多种：如INF-1b,INF-2a,INF2b,INF-,IL-2,IL2-ser125,IL-11,G25F,GM-CSF,-SK，GH，EPO，TPO，EGF，EGF衍生物，bFGF，Ins，TNF衍生物，脑钠素，心钠素，抗IL-8单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，CHO乙肝疫苗，痢疾疫苗，WuT3单抗（抗CD3CMAb，抗肾移植排斥），131I-chTNT人鼠嵌合型单抗（治肺癌），P53腺病毒抗癌注射剂，葡激酶等，已进入临床的有SARS疫苗，禽流感疫苗，艾滋病疫苗。中国生物制药企业近代生物制药企业通过GMP的厂家已近200家，年产值400多亿元，仅占全国医药产值7.5%发展空间可观（美国400多亿美元/年），已开始进入自主创新阶段。如：（1）-bFGF(全球首家上市)；（2）思凯通（注射SK，1997年上市）；（3）注射用重组葡激酶（2003年上市）；（4）今又生Gendicine（P53腺病毒注射剂）；（5）TNF衍生物,.,2.哺乳动物细胞表达产物所占比重快速增加2000年已批准创新生物技术药物：酵母表达产品2种，E.coli表达产品4种，分子量均在3.5KDa6KDa,表示它表达多肽有优势，而通过动物细胞表达系统22种（包括抗体、酶、凝血因子）如：TNKase(t-pA突变体)；（58KDa）；AlsuraZyme（laromidase）(58KDa治疗粘多糖病)Fabrazyme（Algasidasebeta,100KDa,治疗Fabrys病）3.治疗性抗体发展迅猛FDA已批准17种治疗性抗体，在抗肿瘤、治疗风湿性关节炎，防止感染、抗血小板凝集等方面疗效突出。在369种进入临床试验的生物技术药物中有75种是抗体类产品，预计2008年会有17种上市。如抗TNF嵌合抗体，TNF-R-Fc融合蛋白。抗体人源化分为（1）嵌合抗体：用人源抗体恒定区替换鼠源抗体恒定区，保留抗体可变区。(2)人源化抗体:可变区中仅CDR（轻链可变区）为鼠源，其FR及恒定区均来自人源。,.,4、干涉RNA（RNAi）RNAinterference，是细胞内外源性或内源性双链RNA，可引起与其同源的mRNA特异性降低，抑制基因表达，是抗病毒、抗肿瘤治疗剂的重要设计方向。5、基因治疗剂：DNA疫苗与基因药物发展迅速，将功能基因与表达载体重组，导入人体细胞，使其在体内表达活性蛋白，产生免疫或治疗作用。已研究成功乳腺癌DNA疫苗（可能对病毒性肿瘤均可获得成功），还有黑色瘤基因治疗也取得突破（使病人晚期肿瘤消失），将病人的T-cell分离出来，用肿瘤抗原受体基因改造T-cell，再注入人体，可以对黑色素瘤产生有效清除作用。,.,第二节生物药物的性质与类别,一、生物药物的特性（CharacterizationofBiopharmaceutics）（一）生物学特性：1、组成、结构与天然活性物质一致，是生物进化与自然选择的结果。2、具有调节、控制生物功能，战胜疾病的物质基础。3、对人体进行补充、调整、增强、抑制，替换或纠正代谢失调更为合理和有效。4、活性强，毒副作用一般较少，针对性强，疗效确切，还有营养作用。5、是创新药物的优良先导物，通过分子设计可以研制新型有效药物，如从抑长素研制环己肽（环6肽）。28肽环6肽Pro-Phe-D-TrpPe-Thr-Lys,.,(二)、化学特性：（1）含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高；（2）组成结构复杂，具严格空间结构，才有生物活性。对多种物理、化学、生物学因素不稳定，故研究时要执行GLP规范，生产时要求GMP管理。（3）活性高，有效剂量小，对制品的有效性，安全性要严格要求（包括标准品的制订）。,.,二、生物药物的类别：共分4大类（一）天然生物药物1微生物药物microbilmedicine由微生物产生的生理活性物质：包括初级及次级代谢产物和转化产物。（1）抗生素：抗菌、抗肿瘤抗生素，如青霉素，链霉素，红霉素，四环素，多粘菌素，两性霉素B，氯霉素，利福霉素，磷霉素等。（2）酶抑制剂：如克拉维酸，-内酰胺酶抑制剂(青霉素增效剂)（3）免疫抑制剂:如环孢霉素A,.,2生化药物（含海洋药物）：Biochemicalmedicine用生物化学的原理与技术从动植物、海洋生物和微生物制取的生化活性物质。（1）氨基酸类药物aminoAcid如胱AA、色氨酸、精氨酸等。（2）多肽类药物Polypeptide如缩宫素、加压素等。（3）蛋白质类药物如人血白蛋白，r-球蛋白（4）酶类药物如胃蛋白酶，尿激酶（5）辅酶类药物如CoQ10,CoASH（6）核苷酸与核酸类药物如RNA注射液：PolyI:C（7）多糖类药物（polysaccharide）:如肝素、玻璃酸。（8）脂类药物：如去氢胆酸，胆红素、PGE1、PGE2。,.,（二）生物技术药物（新生物制品）Biotech-drugs1.DNA重组药物（DNArecombinantmedicine）基因工程与蛋白质工程药物（1）细胞因子干扰素类药物:IFN,IFN-,IFN（2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子:IL-2,IL-6,IL-11;TNF-,TNF-R（3）造血系统生长因子类：G-CSF,GM-CSF,EPO,TPO,SCF（4）重组蛋白和多肽类激素药物：Ins，rHGH,FSH,LH,HCG（5）生长因子类药物:EGF，PDGE，TGF，NGF（6）心血管病治疗剂与酶制剂:水蛭素，t-PA，尿激酶，门冬酰胺酶（7）重组蛋白疫苗与基因工程治疗性抗体：乙肝疫苗、丙肝疫苗、对淋巴瘤CD3单抗（OKT3）抗排斥。HER-2（表皮生长因子受体抗体），抗乳腺癌转移（人源化抗体）,.,2.基因药物（核酸类药物）(1)核酸疫苗：将目的基因与表达载体构建成重组体导入人体，使其表达免疫蛋白，呈递免疫应答，如乳腺癌疫苗。(2)反义药物ISIS2900，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎。（三）合成或半合成生物药物：如催产素，降钙素，PEG-腺苷脱氨酶，PEG-门冬酰胺酶,.,第二章生物制药工艺技术基础Basisofbiopharmaceuticaltechnology第一节微生物制药工艺技术基础,一、菌种的选育与保芷1自然选育是一种纯种选育方法，依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变型菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。操作：单孢子悬浮液分离及单菌落培养筛选纯培养：从一个单细胞微生物取得的后代培养称纯培养方法：（1）平板划线法（2）稀释平板法,.,2诱变育种（1）诱变处理：化学诱变；物理诱变（2）代谢调节选育（3）基因重组技术改变代谢途径（4）原生质体融合突变株筛选一般进程如图所示第三第四轮同第二轮,.,3菌种保存,（1）保存目的：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法（4）菌种保芷方法：斜面低温保存4，湿度105倍)已有高温DNA聚合酶，故操作已自动化（PCR仪）（3）化学合成法在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp100bp可用化学合成法直接合成DNA。,.,2DNA重组体的构建将目的基因与基因载体连接，构成重组体基因载体（Vector）有（1）E.coli载体如PBR322（非表达型载体）表达型：PUC质粒，PKK233-3，PET系统：PET28a，PET32（2）芽孢杆菌载体如PUB110pE194和pC194（3）链霉菌载体如PIJ101PSG5（4）噬菌体载体如gt10(非表达型)gt11(表达型)*非表达型用于构建克隆基因扩增与鉴定，表达型用于构建生产目的蛋白的工程菌。一般目的基因10Kb，可选用噬菌体DNA为载体。,.,cDNA与载体连接方法同聚尾连接法用3-脱氧核苷末端转移酶，使cDNA与载体DNA3末端带上互补同型多聚体序列：如质粒-poly-C（或A）cDNA-poly-G(或T)两者退火后，经T4DNA连接酶封口，构建重组体。,3脱氧核苷转移酶cDNAcDNA-polyA(C)dNTP载体DNA-polyT(G)人工接头连接法用T4DNA连接酶在平端上连接上人工接头，再用工具酶切开成粘性末端。目的基因+cDNA接头工具酶（内限性内切酶）,.,3重组体的表达系统表达方式常用有胞浆内表达分泌表达周质表达（1）原核表达系统E.coli；芽孢杆菌Bacillus；链霉菌StreptomycesE.coli表达系统的优点：易大量生产，成本低，周期短，相对较安全，已公认可供大量生产。缺点：多为胞内表达、纯化困难，易生成包含体，复性困难，产物多为AuG(Met)起始密码，有内毒素污染的可能。,.,（2）真核表达系统1）酵母属单细胞真核生物非分泌型载体如PA815,PPIc2,分泌型PHIL-S1优点：易培养无毒性可分泌表达产物可糖基化常用酵母表达体系酿酒酵母（Saccharomycescoeviviae）表达，毕赤酵母（pichiapsatoris）特点：启动子为AOX1,属乙醇氧化酶I基因,受甲醇诱导易高密度发酵,达100g/L(10%)已成功用于表达INF,乙肝表面抗原疫苗,Ins,Aibumin2）动物细胞表达体系A哺乳动物细胞CHO(病毒质粒为载体)B昆虫细胞家蚕细胞,如生产INF,.,4表达与表达产物的纯化（1）选择高效表达工程菌，优化发酵条件（培养基组成，接种量，温度，溶氧，pH，诱导作用，发酵动力学）进行扩大发酵.（2）分离纯化要求：技术条件要温和选择性要高收率要高步骤要少，时间短E纯度95%。,.,表达产物流程*inclusionbodies由表达产物重组蛋白,宿主蛋白和膜蛋白组成，以表达产物为主，其一级结构正确，但空间结构错误，没有活性，不溶于水，可低速离心收集包涵体，用变性剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。,.,为防止或减少包含体的形成常用方法：（1）降低培养温度从37降到30可显著降低包含体形成率。（2）以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。硫氧还原蛋白是E.coil的一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，表达产物聚集于粘附区，通过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目的蛋白。,.,二、酶工程制药技术基础1、什么是酶工程（1）酶的发现，分离，纯化与酶制剂的工业化应用。（2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）酶工程技术的工业化应用。2、优点（1）固定化稳定性提高（2）可重复使用，提高使用效率，降低成本（3）提高强度，便于连续化，自动化，规模化生产（4）便于产物的分离、纯化,.,3、制备方法：吸附法，包埋法、共价键结合法、交联法（1）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺如用卡拉胶固定L-苹果酸合成酶生产L-苹果酸，卡拉胶加水（加热）溶解成5%（冷却40）加入产酶菌体（搅拌均匀）冷却（冷冻）切块（1-2CM2）KCl固化装柱（2）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合，一般纯酶固定化，用此法适用批量小，附加值高的产品生产。如用CNBr活化纤维素载体再与酶蛋白共价结合。利用固定化胰蛋白酶亲和层析制备胰蛋白酶抑制剂（3）交联法：用双功能试剂，将酶与载体交联固定化如用二醛和明胶交联固定化前列腺素合成酶合成PGE1，PGE2,.,4固定化酶性质：（1）通过固定化酶活一般下降，因酶的空间结构发生变化，或酶与底物结合时有空间位阻，因此要测定固定化酶的表现活力，再计算总活力，并与使用半衰期的延长时间，统计分析固定化工艺的有效性（2）提高稳定性，因固定化酶表现活力下降，但稳定性提高，因此其稳定性和测定对评价工艺效益十分重要，半衰期t1/2=0.693KDKD=2.303lg(ED)/(E)为起始活力，E为时间t后残留活力。故常常要研究E的操作，储存稳定性或对pH对热的稳定性和对蛋白酶的稳定性。通过E一般可以提高稳定性（包括对温度，pH，蛋白酶，变性剂和抑制剂的耐受程度）因此有利工业化的连续化与自动化应用。所以在生物工艺中就得到广泛应用。如制造r-氨基丁酸，天冬氨酸，L-苹果酸，丙氨酸，色氨酸，苯丙氨酸等。还用于从丙烯氰生产丙烯酰胺,.,第四节生物制药工艺中试放大设计一、中试放大目的与规模1目的：（1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供应临床前与临床研究；（2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，保证能在以后生产中应用。二、规模：中试是由小试转入工业化生产的过渡性研究，是取得成功产业化的关键。,.,三、中试放大特点1、改进小试操作，稳定工艺2、提高收率，提高产品质量3、降低消耗，确定原辅料质控标准4、形成批量生产，制定制造规程和检定规程四、中试放大时应具备的条件（1）有稳定的工艺：收率，质量可靠（2）操作条件基本确立（3）已建立中间品和成品分析方法（4）生物材料已鉴定（5）物料平衡、三废处理已基本解决（6）中试规模、产品产量，规模已确定（7）安全生产已有方案,.,五中试放大要解决的问题（1）原辅材料规格（2）设备选型与材质选用（3）反应条件（4）原辅料中间品、产品质控标准与检定方法（5）下游工艺优化与稳定制造规程的制定六中试放大方法与总结内容1、放大方法（1）经验放大（2）相似放大（3）数学模型放大2、总结内容：（1）确定工艺路线，优化工艺条件，制定制造规程。（2）制定岗位操作、投产（3）进行材料衡算（4）安全生产与处理（5）原辅料及产品质控方法与标准测定。（6）产品规格标准制定（7）消耗定额，成本核算，工时，生产周期计算。中试完