第6章 分子生物学研究方法(下)PPT课件

.1，第6章分子生物学研究方法(下)，2，转录组：指通过转录细胞中基因组DNA获得的所有转录物，以及转录物在特定细胞发育时期或特定生理条件下的表达水平，所有转录物，所有MRNAS，6.1基因表达研究技术，6.1.1转录组测序。EST(表达序列):EST是通过在5端和3端的单一测序从随机选择的cDNA克隆获得的一个短的部分序列，代表完整基因的一小部分。在数据库中，长度通常为20到600bp，平均长度为360120bp。科技英语来源于在一定环境下由一个组织的总基因构建的一个cDNA文库，所以科技英语也可以指示组织中每个基因的表达水平。嘿。4，基因序列分析(SAGE):这是一种基于DNA测序分析整个基因组表达模式的技术。SAGE原则：1 .一个9 10个碱基的短核苷酸序列标签包含足够的信息来唯一地识别一个转录物。例如，一个9个碱基的序列可以区分262，144个不同的转录本，而人类基因组估计只编码80，000个转录本，所以理论上每个9个碱基的标签可以代表一个转录本的特征序列。2.如果9个碱基的标签能够集中在一个克隆中进行测序，并且获得的短序列核苷酸序列能够以连续数据的形式输入计算机进行处理，那么就可以分析成千上万的mRNA转录本。5，方法：使用9-11bp作为标签=49=262144来组合串联标签，并通过在接头两端的聚合酶链反应扩增对扩增产物进行测序。通过基因库或EST数据库对每个标签进行比较，以确认标签所代表的基因表达。samplefragmentationlibraryreparationsequenceingactiondataanalysis，Roche 454焦磷酸测序焦磷酸测序，Illuminanasolexa合成测序SequencebySynthesize。全固态连接测序，高通量测序技术简介。Illuminanasolexa合成测序的基本原理。9，克隆单分子阵列单分子克隆，每1米簇约1000个分子，每100毫秒簇约1000个簇，每种体验约4000万个簇，10，可逆性末端化学可逆终止反应，所有4个标记的核苷酸1反应，11，合成测序(SBS)，首次碱基结合，循环1:添加测序试剂，去除未结合的反馈，检测信号，循环2-N :添加测序试剂和重复，1。在每次测序反应中加入四种带有荧光标记的脱氧核糖核酸(dNTP)，其末端有一个可被去除的封闭基团2，每次反应中只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3，信号读取结束，用化学方法去除封闭基团。进行下一步测序反应。12，theidentityofachbaseofclusterisradofffromssequenceimages根据在每一点的每一轮反应中读取的荧光信号序列被转换成相应的DNA序列，Basecallingfromtherawdata，13，IlluminaSolexa测序工作流程，IlluminaSolexa技术，14、参考基因组序列的生物信息分析、基因结构优化鉴定、基因选择性剪接预测、新转录单核苷酸多态性分析、基因融合鉴定。15、5 . 4 . 1用RACE方法克隆基因全长(RapidAmplificationofcDNAEnds)，根据已知片段设计引物，用RACE技术获得基因全长cDNA序列。在CDN 5RACE CDNa3的A5末端快速扩增在3RACE的3末端快速扩增。16，TdT原理，末端脱氧核苷酸转移酶，5RACE原理。17，17，适配器添加方法原理，18，自对准方法，19，3RACE是由与寡核苷酸(dT)连接的锚定引物引发的第一条cDNA链的合成，寡核苷酸在逆转录酶的作用下可以与聚腺苷酸配对。模板基因被核糖核酸降解。通过通用锚定引物和基因片段内的特异性引物进行聚合酶链反应扩增，获得目标3片段，并通过巢式聚合酶链反应方法继续检测和扩增。核糖核酸的选择性剪接是指通过不同的剪接方法从一种核糖核酸前体产生不同的核糖核酸剪接异构体的过程。可分为平衡剪切、5选择性剪切、3选择性剪切、外显子缺失剪切和互斥剪切。逆转录聚合酶链反应通常用于研究基因是否存在选择性剪切。果蝇Dscam基因通过选择性剪接，6.1.2RNA选择性剪接技术，可以产生超过38，000种可能的基因异构体。21，不同类型的选择性剪接，逆转录聚合酶链反应检测5个拟南芥转录调节因子基因的选择性剪接，22，核酸杂交，核糖核酸，脱氧核糖核酸1，脱氧核糖核酸2，脱氧核糖核酸，(1)脱氧核糖核酸变性和复性，(1)脱氧核糖核酸变性，(1)定义：某些物理和化学因素导致两条脱氧核糖核酸链之间的氢链断裂成一条链的过程，称为脱氧核糖核酸变性。变性方法：(1)热变性：当温度升至90100时，双链核酸分子间的氢键完全断裂。(2)酸碱变性：当酸碱度低于3或高于10时，双链核酸分子之间的氢键断裂。(3)化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等。断裂双链核酸分子之间的氢键。变性后物理和化学性质的变化：粘度降低，密度增加，紫外吸收值增加，复性(退火):1。定义：变性单链核酸分子在一定条件下根据碱基互补原理重组成双链核酸的过程，称为复性或杂交。两条具有互补序列的单链核酸可以互补形成双链：脱氧核糖核酸/脱氧核糖核酸、核糖核酸/脱氧核糖核酸、核糖核酸/核糖核酸、寡核苷酸/脱氧核糖核酸和寡核苷酸/核糖核酸。复性过程(1)单链分子之间碰撞形成局部双链(2)如果局部双链周围的碱基不匹配，双链被再解离(3)如果局部双链周围的碱基匹配，形成中心序列(4)形成完整的双链分子。26，将核酸分子杂交，将具有互补特异性核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，并退火其相应的同源片段以形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，形成的双链分子称为杂交核酸分子。分子杂交的基本方法，Southern印迹法，Northern印迹法，原位杂交，斑点印迹法，Western印迹法，Eastern印迹法，液相杂交，固相杂交，28，核酸分子杂交(固相杂交)操作程序，待测核酸样品的制备，分离，变性，转移，DNA片段的固化，杂交，标记核酸探针的添加，杂交信号的检测，标记核酸探针，预杂交，核酸探针的制备，冲洗以去除不参与杂交的标记探针， 和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，和，应用：基因组DNA基因诊断的定性和定量分析，分子克隆，法医学等。 30岁。在大多数核酸杂交反应中，通过凝胶电泳分离的脱氧核糖核酸或核糖核酸分子必须通过毛细管或电导作用转移到滤膜上，并根据它们在凝胶中的位置被“吸干”。因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。材料：尼龙过滤膜、硝化纤维过滤膜和二乙基氨基乙基纤维素过滤膜(DEAE)。步骤：首先，将分离的核酸样品转移至固体支持滤膜-核酸印迹转移。第二，用带有放射性或其它标记的核酸或核糖核酸探针杂交滤膜。31，杂交模式，32，还有南风的主要步骤。1.待测DNA样品的制备和酶消化。待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳3。凝胶中的DNA变性：碱性变性4。南方印迹：毛细管虹吸印迹，电转移印刷和真空转移5。南方杂交(预杂交、杂交和洗膜)6。杂交结果的检测，33.南方凝胶转移杂交技术，34，1。待测DNA样品的制备及原理(4) Southern印迹)通过某种方法，即印迹，将待检测的核酸分子转移并结合到某种固体支持物(如纤维素膜)上。固体支持物的选择(1)理想的固体支持物应具有以下特征：(1)具有很强的结合核酸分子的能力；(2)不影响与探针的杂交反应；(3)它与核酸分子牢固结合；(4)机械性能好，非特异性吸附少；(3)普通固体支持物(38，4.2)硝酸纤维素膜具有较强的吸附能力和较低的杂交信号背景。缺点是DNA分子结合不牢固尼龙膜：优点是结合单链和双链DNA的能力强于硝酸纤维素膜；缺点：杂交信号背景高化学激活膜：优点：DNA与膜共价结合；它对不同大小的DNA片段具有相同的结合能力。缺点：结合能力低于上述两种膜。39，4.3常用的Southern印迹法(1)毛细管虹吸印迹法，利用浓盐转移缓冲液的推动作用将凝胶中的DNA转移到固体支持物上。其基本原理是容器中的转移缓冲液含有高浓度的氯化钠和柠檬酸钠，减缓上层吸水纸的虹吸作用，冲洗液通过滤纸桥、滤纸、凝胶和硝酸纤维素滤膜向上移动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上移动，凝胶中的DNA片段移出凝胶并停留在膜上。(2)电迁移法，利用电场电泳将凝胶中的DNA转移到固体支持物上。(3)真空转移法。该方法的原理与毛细管虹吸法相同，除了将膜放置在真空室上，使过滤膜在底部，凝胶在顶部。通过真空作用将转移缓冲液从上部容器通过凝胶和滤膜泵送到下部真空室，并驱动核酸片段转移到凝胶下的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。各种转移方法比较：一)毛细管虹吸法：操作简单，不需要特殊的转移仪器，但转移效率低(扩散法70%，毛细管法80%)，耗时长。Ii)电迁移法：效率高、耗时少、需要特殊的转移仪器和严格的转移条件。Iii)真空转移法：效率高，耗时少，需要专用的真空转移仪。转移的最佳条件是：1)固定基质的选择2)转移前的预处理：脱氧核糖核酸和核糖核酸分子变性，而蛋白质需要从凝胶中除去十二烷基硫酸钠。Iii)大分子的转移对于分子量较大的DNA片段，转移必须在原位切割后进行，切割的DNA分子的最佳长度为1-2kb。步骤为：0.25盐酸处理凝胶两次(每次15分钟)水洗0.5氢氧化钠/1氯化钠两次，每次15分钟转移。44，5，Southern杂交1，预杂交：可与封闭膜上的DNA结合的位点的预杂交溶液是没有DNA探针的杂交溶液2，杂交：液相中的DNA探针和膜上待检测的DNA杂交双链DNA探针需要热变性成单链，然后杂交3，膜洗涤：除去游离的放射性探针或非特异性结合的DNA。45，6。杂交结果的检测、化学显色或放射自显影。46岁，被贴上探针，南方政府。47，probe指的是一种技能，该技能利用标记分子对其他分子的识别来实现后者的检测。我们称之为标记分子探针。从化学和生物学的角度来看，探针是一种在反应后带有合适的检测标记并与特定目标分子反应的分子。例如，抗体-抗体、凝集素-碳水合物、抗生物素蛋白-生物素、受体-配体(配体)和互补核酸之间的杂交都属于探针-靶分子反应。(1)探针类型，基因组DNA探针，c DNA探针，RNA探针，寡核苷酸探针，(2)标记物理标记所需的特征：高灵敏度不影响碱基配对的特异性，不影响探针分子的主要物理和化学性质，不影响酶促反应活性，或影响很小。检测方法具有高灵敏度和高特异性。探针标记物放射性标记物32P高活性半衰期14.3d35S放射性弱半衰期87.1d3H放射性弱半衰期12.35a非放射性标记物半抗原：生物素，高速配体：生物素是亲和素配体荧光素：异硫氰酸荧光素，罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素化碱性磷酸酶，可使发光底物发光，51，生物素，亲和素，52，(3)标记方法体内标记方法：用核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢过程中，核素被掺入新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可被掺入DNA，3H-尿苷可被掺入核糖核酸。体外标记法：化学标记法：标记分子上的活性基因与探针分子上的一些基因反应，标记直接与探针分子结合。酶标记法：标记物预先标记核苷酸，然后通过酶法将标记的核苷酸掺入探针中。54，酶标记法转化镍，1。脱氧核糖核酸酶用于在脱氧核糖核酸双链2上产生单链缺口。大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切核酸酶活性用于从缺口3的5-