蛋白质与核酸相互作用的试验方法学研究.ppt

DNA-蛋白质相互作用研究实验,引言,1.很多细胞的生命活动涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用：DNA的复制和重组；mRNA的转录和修饰；病毒的感染与增殖等2.随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究显得尤为重要。而基因表达调控是功能基因组学的一个重要研究领域。而要深入研究基因表达调控的分子机制必须要研究DNA与蛋白质的相互作用。3.在重组DNA技术发展以来，已相继分离到大量的具有重要生物学意义的基因。在这种情况下科学工作者开始把自己的研究兴趣逐渐转向DNA结合蛋白这一课题上。,凝胶阻滞试验DNaseI足迹试验甲基化干扰试验体内足迹试验酵母单杂交技术染色质免疫沉淀技术噬菌体展示技术核酸适体技术生物信息学方法蛋白质芯片技术及纳米技术,一、凝胶阻滞试验（DNA迁移率变动试验DNAmobilityshiftassay）,1原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。,2主要步骤及内容：制备探针DNA（P32放射性同位素标记DNA）同细胞蛋白质提取物一道温育，形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置,不存在与DNA结合的蛋白质时存在与DNA结合的蛋白质时,凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性,超量的非标记的竞争DNA(competitorDNA）,材料及试剂：2X结合缓冲液：20mMTrispH7.5、100mMNaCl、2mMEDTA、10%甘油、poly(dI-dC)(5mg/mlinTE)、BSA(10mg/ml)、P32-标记探针缓冲液C：20mMHEPESpH7.9、25%glycerol、420mMNaCl、1.5mMMgCl2、0.5mM二硫苏糖醇、0.5mM苯甲基磺酰氟化物、0.2mMEDTA4%天然的聚丙烯酰胺凝胶(50ml)：5ml40%丙烯酰胺(30:1)、2.5ml5X四溴乙烷，41.95mlH20、0.5ml10%APS（过硫酸铵）、50ml四甲基乙二胺、0.25X四溴烷电泳缓冲夜。填充染料：0.2%溴酚蓝、0.2%二甲本蓝、50%甘油操作步骤：1.配置反应混合液：探针DNA(1ng/ml)0.1ml、dH206.3ml、2x结合缓冲液12.5ml、BSA(10mg/ml)1.0ml、poly(dI-dC)(5mg/ml)0.1ml、2.在细胞提取物中加入缓冲液C至5ml。3.加1015mg上述溶液（5ml)到反应混合物中，总体积应不大于25ml。4.在室温下培养20min。5.加入2.5ml的填充染料。6.装载样品到4%的聚丙烯酰胺凝胶柱中。7.室温下跑电泳2.5h，至溴酚蓝距底部1cm处停止。8.80下干燥凝胶，进行放射自显影处理。,二、DNaseI足迹试验(DNaseIfootprintingassay),DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。首先是单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生“DNaseI保护”，尿素变性，PAGE分离及放射性显影，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相应于DNA结合蛋白的位置上由于DNA结合蛋白的保护作用而形成了空白区域。,如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区的精确序列。,三、甲基化干扰试验,根据DMS（二甲基亚蓝）能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计,先用DMS处理DNA；（并控制反应条件，使之达到平均每条DNA分子只有一个残基被甲基化）将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当细胞提取物一道温育；并做凝胶阻滞试验。经电泳分离后，从凝胶中切除具有结合蛋白的DNA条带和没有结合蛋白的DNA条带，并用六氢吡啶处理之。,检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而后的蛋白质结合作用会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间的相互作用模式。DMS化学干扰只能在G和A残基甲基化，不能使T和C甲基化。故本实验为足迹实验的补充手段。,四、酵母单杂交技术,真核生物中，转录因子中DNA结合结构域(DNA-bindingdomainBD)与转录激活结构域(activationdomainAD)能够相互独立发生作用。酵母中的转录因子GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶启动下游报告基因的转录。,设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中;将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中;若文库蛋白与目的基因相互作用可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来.注：这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白.酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作用的研究。,不足以充分反映生理条件下，DNA与蛋白质相互作用的真实情况。因为，高等生物的基因组有染色质结构，用以上所提到的方法分析得到的某段DNA与蛋白质，在生理状态下，这段DNA很可能并不与其相对应的因子相结合。另外，染色质结构本身是动态的，DNA与非组蛋白在生理状态下的相互作用通常是瞬时的，以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件,以上技术都有一定的局限性,八、染色体免疫沉淀技术Chromatinimmunoprecipitation（ChIp）,1.技术介绍在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来,2、主要步骤及内容,细胞的甲醛固定超声波断裂染色质氯化铯等密度离心纯化交联的染色质染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化交联反应的逆转和DNA的纯化染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步验证,1.细胞的甲醛固定在1%甲醛的作用下，DNA碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的氨基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的DNA和蛋白质上的氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。加入甘氨酸来终止交联反应。,2.超声波断裂染色质甲醛交联后的染色质对限制酶和DnaseI高度抵抗，因此通常使用超声波使得染色质断裂。打断后的染色质片段的平均长度应该在500-1000bp左右。（可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定）,3.氯化铯等密度离心纯化交联的染色质氯化铯等密度离心可以除去未交联的蛋白质、DNA和RNA样品中加入0.5%的十二烷基肌氨酸钠，通常在4000rpm离心72h。离心后，用连接到蠕动泵的0.25mm毛细管从梯度的底部分步收集染色质组分，在4透析过夜。,4.染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化用目的蛋白特异性的抗体进行染色质免疫沉淀。抗体的量要进行优化防止非特异的结合。用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀复合体。经过洗涤除去非特异结合的染色质后，用1%SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合体。,5.交联反应的逆转和DNA的纯化在免疫沉淀复合体中加入不含Dnase的Rnase，proteinaseK。65保温6h使交联逆转。经酚氯仿抽提-乙醇沉淀纯化DNA。纯化的DNA极少，可用色谱定量。,6.染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定染色质免疫沉淀的DNA的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和PCR分析;如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情况,找出反式作用因子的结合位点,可以采用Southern杂交、ChIP克隆和DNA芯片方法。,7.目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步验证染色质免疫沉淀分析得到的结果有很大一部分是假阳性，需要采用其他方法验证结果的真实性。用PCR方法进行独立的ChIP分析、电泳迁移率变动分析、酵母单杂交系统及荧光素酶报告系统最终确定目的蛋白与靶DNA序列的特异性结合。,近年来发展起来的基因芯片（chip）染色质免疫沉淀ChIP技术相结合(chip-ChIP)的方法要一个PCR步骤来扩增染色质免疫沉淀富集的DNA。特异性染色质免疫沉淀的DNA和对照DNA的PCR产物分别用Cy5和Cy3荧光光标记，用于与含有整个基因组的DNA芯片进行杂交。