四环素类抗生素VIP

.,第六章四环类抗生素,一概述A四环类抗生素的理化性质B化学性质和降解反应二四环素的发酵工艺A生产菌种B种子制备及控制要点C影响发酵的因素及工艺控制要点三四环素的提取和精制,.,一概述,四环素类抗生素为四并苯（Naphthacene）衍生物，具有十二氢化并四苯基本结构,.,发现,1948年由金色链丝菌的培养液中分离出金霉素1950年从皲裂链丝菌培养液中分离出土霉素,.,1953年发现将Chlotetracycline脱去氯原子，可得到四环素随后发现用在不含氯的培养基中生长的链霉菌菌株发酵可生产Tetracycline,.,由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素（I）、土霉素（II）、四环素（III）及半合成的抗生素均是氢化并四苯的衍生物，具有共同的菲烷（母核）。,四环素类抗生素概况:,.,（I）R=C1，R=H，加氯（金霉素）（II）R=H，R=OH，加氧（土霉素）（III）R=R=H(四环素),.,有相似的抗菌谱理化性质相近,均为黄色的结晶性粉末，味苦。在水中溶解度小。分子中含酚羟基和烯醇型羟基，显弱酸性；同时含有二甲胺基显弱碱性，故为两性化合物；能溶于碱或酸液中。,.,四环素片：其盐酸盐为黄色结晶性粉末；无臭，味苦；有引湿性；遇光色渐变深，在碱性溶液中易破坏失效。在水中溶解，在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。是广谱抑菌剂，高浓度时具杀菌作用。,.,.,抗菌作用1.抗菌谱广（1）对G+菌作用不及青霉素和头孢菌素（2）对G-菌作用不及氨基糖苷类和氯霉素（3）对支原体、衣原体、立克次体、某些螺旋体作用强。（5）对结核杆菌、绿脓杆菌、病毒、真菌无效,.,临床常用的有：四环素、土霉素、金霉素、多西环素等。按其抗菌活性大小顺序依次为：1、米诺环素、2、多西环素、3、美他环素、4、金霉素、5、四环素、6、土霉素。,.,作用机制：四环类抗生素可与微生物核糖核蛋白30S亚基接合，通过抑制氨基酰-tRNA与起始复合物中核蛋白体的结合，阻断蛋白质合成时肽链的延长。(与核蛋白体30s亚基结合而抑制细菌蛋白质的合成.引起细菌细胞膜通透性增加)四环类早期主要用于治疗耐青霉素菌引起的感染。本类抗生素属广谱抗生素，对G和G及立克次氏体和大病毒有抑制作用。,.,四体感染（多为首选）,立克次体：斑疹伤寒、恙虫病衣原体：鹦鹉热，衣原体肺炎，沙眼衣原体引起的非淋菌性尿道炎、子宫颈炎、性病淋巴肉芽肿、沙眼支原体：支原体肺炎、盆腔炎螺旋体：回归热,.,主要优点是：抗菌谱广、吸收好、副作用小、价格低廉、不引起过敏反应。但可能引起严重的胃肠道反应和呕吐等。土霉素治“猪瘟”及“猪喘气症”的疗效远比四环素为好。从土霉素又可合成强力霉素和甲烯土霉素。由去甲基金霉素合成二甲胺四环素最经济方便。二甲胺四环素目前是四环类中评价最好的一种药。,.,四环素牙,.,.,金霉素(氯四环素):副作用大目前只外用，用于治疗麦粒肿(偷针眼)、结膜炎、沙眼饲料添加剂(兽用四环素类药物）,.,应用注意事项,宜空腹服药，不宜与抗酸药等药同时服用，必须合用时，至少间隔3小时,宜空腹服药，不宜与抗酸药等药同时服用，必须合用时，至少间隔3小时,肝肾功能不全者不宜用,注意药物相互作用,.,1.四环类抗生素及其理化学性质,化学名6-甲基-4-(二甲氨基)-3,6,10,12,12a-五羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-2-并四苯甲酰胺(6-Methyl-4-(dimethylamino)-3,6,10,12,12a-pentahydroxy-1,11-dioxo-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-2-naphthacenecarboxamide。,.,一结构和物理性质,1、发色团：酮基和烯醇基共轭双键系统，决定颜色和紫外特征吸收峰265nm、350nm2、两性化合物功能团：二甲胺基（pKa=9.5）；酚羟基（pKa=7.5）；三羰基甲烷系统（pKa=3.3）；pI=5.4,.,3、溶解度：4PH8时，可得高浓度水溶液，过剩的酸能防止水解。pH=4.5-7.2则难溶于水。4、稳定性：固体相当稳定，可存放5年以上，效价无明显下跌；溶液除DCTC（去甲基金霉素）外均不稳定；对氧化剂包括空气中的O2都不稳定，碱性时特别易氧化，颜色变深。5、旋光性,.,二化学性质,酸性条件下1脱水反应：在酸性条件下，四环素类抗生素C-6上的羟基和C-5a上氢发生消除反应，生成无活性橙黄色脱水物(Anhydrotetracycline)。由于C-6上的羟基与C-5a上的氢正好处于反式构型，在酸性条件下有利于发生消除反应。,.,2差向化合物在pH2-6条件下，C-4二甲胺基很易发生可逆反应的差向异构化，生成差向异构体（4-Epitetracycline）。3某些阴离子如磷酸根、枸椽酸根、醋酸根离子的存在，可加速这种异构化反应的进行。4位差向异构化产物在酸性条件也还会进一步脱水生成脱水差向异构化产物。,.,四环素类药物的脱水产物及差向异构体的抗菌活性均减弱或消失。差向异构体的活性不仅减弱，而且毒性为四环素的2-3倍，主要毒性为可引起Fanconi综合征，肾小管的在吸收功能受损，产生烦渴、蛋白尿、糖尿、氨基酸尿、低血钾、高尿酸血症和酸中毒。四环素与其4-差向异构体在一定的条件下以动态平衡关系而互存。因此各国药典都对其含量进行不程度的控制。,.,.,碱性条件下（C环上反应）在碱性条件下，由于OH-的作用，C-6上的羟基形成氧负离子，向C-11发生分子内亲核进攻，经电子转移，C环破裂，生成无活性的具有内酯结构的异构体(isotetracycline)。,.,与金属离子的反应（B,C环上反应）四环素类抗生素药物分子中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在近中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物。与钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐，与铁离子形成红色络合物；与铝离子形成黄色络合物。,.,二、四环素类抗生素的构效关系及作用机制和耐药性,1.四环素类抗生素的构效关系1.四环素类抗生素结构中的四环是生物活性所必须的结构，A环中1-4位的取代基是抗菌活性基本药效团，改变其结构活性消失，仅可在酰胺基上的氢进行改变理化性质的前药修饰。2.C11-C12a位的双酮系统结构对抗菌活性至关重要。,.,3.5-9位的取代基为非活性必须基团，对其改造可改变其抗菌活性、化学稳定性和药代动力学性质。4.6位碳可以硫原子替代，其抗菌作用优于多西环素，并具有长效、抗菌谱广、口服后有较高的浓度的特点。但其作用机制与四环素类不同，为干扰细胞质膜功能，由于膜损伤，阻止了底物蓄积，引起细胞膜里辅因子的丧失，因而6-硫四环素的毒副作用比较大。,.,2.四环素类抗生素的作用机制和耐药性四环素类主要通过抑制核糖体蛋白质的合成抑制细菌生长。四环素类与30S细菌核糖体亚单位结合，破坏tRNA和RNA之间的密码子-反密码子反应，因而阻止了氨酰-tRNA与核糖体受体A位点的结合，抑制细菌的生长，因此是广谱的抗生素。由于四环素的长期使用，已发现了耐四环素的细菌。细菌对四环素类耐药性主要是由于抗性造成的。原敏感均获得抗性基因后就形成耐药菌，这种抗性基因存在与质粒或易位子中。,.,四环素类抗生素的鉴别试验,1浓硫酸反应四环素类抗生素遇硫酸立即产生颜色，不同的四环素类抗生素具有不同的颜色。根据不同的颜色变化可以区别各种四环素类抗生素。盐酸四环素呈深紫色盐酸金霉素呈蓝色，渐变为橄榄绿色，加水后呈金黄色或棕黄色盐酸土霉素呈朱红色，加水后变为黄色盐酸多西环素呈黄色盐酸美他环素呈橙红色,.,2三氯化铁反应本类抗生素分子结构中具有酚羟基，遇三氯化铁试液即呈色。盐酸四环素：红棕色盐酸金霉素：深褐色盐酸土霉素：橙褐色盐酸多西环素：褐色,.,3薄层色谱法设备简单，操作容易，分离效果亦佳，中国药典、都采用本法鉴别四环素类抗生素本类抗生素及其降解产物在紫外光（365nm）下产生荧光，可用于检出斑点并以对照品进行鉴别。,.,4高效液相色谱法中国药典和USP（25）采用高效液相色谱法鉴别盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素、盐酸金霉素。在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。,.,不良反应胃肠道反应刺激所致。恶心、呕吐、腹部不适等。饭后服减轻（但减少吸收）二重感染敏感菌株受抑，不敏感菌株大量繁殖。,.,对骨、牙生长的影响,沉积于骨、牙，与Ca2+结合,变黄发育不全,畸形、龋齿发育障碍,禁用于,妊娠月以上的妇女8岁以内的儿童,.,肝、肾毒性为长期口服或大剂量静脉给药所致，可致肝脂肪性坏死，加重肾功能不全，易发生于孕妇,过敏反应药热、皮疹、光敏性皮炎等，偶可致剥脱性皮炎6.维生素缺乏制造维生素B、K细菌受抑，致口角炎、舌炎、出血,.,第二节四环素的发酵工艺,一生产菌种1金霉素生产菌种金色链霉菌（S.aureofa-ciens）,通过在培养基中加入抑氯剂和氯的竞争剂时，则能合成95的四环素。2诺卡菌属（Nocardia）、马杜拉放线菌属（Actinomadura）等也能产生四环类抗生素,四环素生产采用合成金霉素的金色链霉菌菌种，通过在特定的培养条件下，控制产生菌的生物合成方向，使其产生95%以上的四环素。,.,3诱变育种采用的方法紫外线，氮芥、乙烯亚胺，放线素K等1959年，刘颐屏利用基因重组技术并结合诱变因素处理，获得的金霉菌“重组2U-84”，发酵水平比出发菌株Uk-81提高40。同时还发现重组体菌株对诱变因素的敏感性增加，这样更有利于获得高产变种的机会。,.,4金霉菌的培养特征金霉菌在马铃薯、葡萄糖等固体斜面培养基中生长时，营养菌丝能分泌黄金黄色色素，但其气生菌丝却没有颜色。孢子在初形成时是白色的，在28培养5-7d，孢子从棕灰色转变为灰黑色。5金霉菌形态孢子形状一般呈圆形或椭圆形，也有方形或长方形，孢子在气生菌丝上排列成链状,.,6金色链霉菌沉没培养的生长时期A第一期（原生菌丝期）孢子吸水膨胀，发芽，长出分枝，分枝旺盛而生长成一个菌丝团B第二期（次生菌丝期）菌丝团散开，主体菌丝两侧的次生菌丝延长、交织成网状，菌丝分枝明显C第三期（分泌期）菌丝趋短或中长状，菌丝侧枝中有中短分枝，菌丝中出现空胞，中后期菌丝更短，分枝减少，成短枝芽状。D第四期（自溶期）菌丝形态趋模糊，最终自溶。,.,二种子制备及控制,1孢子制备,砂土管,母斜面,子斜面,种子罐,发酵罐,影响因子：水、麸皮,.,2种子培养培养基：蛋白胨、花生饼粉、淀粉培养条件：3032，2427h标志：菌丝形态处于第二期末或第三期初；菌体处于代谢旺盛阶段，C、N源明显被利用；pH值下降后又上升，达到pH6.0左右；培养液因菌丝增加而粘稠，色泽逐渐带黄色，有少量四环素出现影响因子：通气、搅拌,.,三发酵控制,四环素生产一般采用二级或三级发酵方式1培养基：N源：花生饼粉，黄豆饼粉，棉籽饼粉，硫酸铵，氯化铵，硝酸铵，尿素等（玉米浆）C源：淀粉，可溶性淀粉，葡萄糖，糖蜜，油脂等无机盐：磷酸盐,.,无机磷浓度是控制菌丝生长率的重要因子，也是金色链霉菌从生长期转入抗生素合成期的关键因素。（表6-7）高浓度的磷酸盐能抑制产生菌体的戊糖循环途径中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，同时促进糖酵解速度，使菌体内能产生NADPH的戊糖循环途径受阻。还原性辅酶是四环素生物合成中的氢供体，另外磷酸盐对合成四环素前体丙二酰CoA的合成有较强的抑制作用，所以生产中要控制发酵培养液中的磷酸盐含量，保证通气效果，提高发酵水平。,.,抑氯剂：抑氯剂对改变金霉素合成方向均有一定作用，但浓度较大时对产生菌都有不同程度的毒性，使用时应注意常用抑氯剂：2，5-巯基1，3，4-噻二唑2-（二呋喃基）-5-巯基1，3，4-恶二唑,.,其他金属离子：铁，硼，钴，锂，锌，钼等消沫剂：植物油、动物油2培养温度28323pH值pH6.06.84溶氧,.,四环素的提取和精制,.,三四环素的提取和精制,1发酵液预处理草酸或草酸和无机酸的混合物调pH1.52.0，四环素转入液体中。注意：低温、短时避免差向化,.,2四环素提取2.1沉淀法四环素发酵滤液，调pH9.0，加入氯化钙，形成钙盐沉淀；沉淀用草酸溶解，草酸钙析出，过滤得滤液；滤液调pH4.64.8，析出四环素粗碱；粗碱再溶于草酸水溶液中，经活性碳脱色，再调pH4.0，即得四环素碱成品。,.,2.2离子交换法2.3四环素纯化四环素与尿素生成复合物而纯化。,.,利福平（rifampicin）1965,为利福霉素的人工半合成品橙红色广谱抗菌,.,抗菌作用,抗菌谱（广）,强,1、G+、G-球菌：金葡、链、肺炎、脑膜炎2、TB3、麻风杆,敏感,G-杆菌：变形、大肠、流感衣原体、支原体某些病毒,.,机理：抑制DNA依赖的RNA多聚酶阻mRNA合成抑菌、杀菌,耐药性：易产生；不宜单用。可能是RNA多聚酶亚单位突变，结合,.,临床应用,1、结核适合于各型结核，联合用药（加其他第一线药）2、麻风为联合用药的必要组分，作用快、强3、其他细菌感染耐药金葡及其他细菌感染：如：肺炎、肺脓肿、心内膜炎、败血症、胆道感染、细菌性脑膜炎、沙眼、病毒性角膜炎等,.,不良反应,1、消化道刺激症状2、肝毒性：转氨酶、肝肿大、黄疸等定期复查肝功能3、过敏反应：皮疹、药热、血小板及白细胞或“流感综合征”多见于大剂量间歇疗法（12次/w）,.,4、神经系统：偶可有嗜睡、共济失调、精神紊乱等5、致畸：早孕禁用6、诱导肝药酶自身诱导加速某些药物代谢：皮质激素、雌激素、口服避孕药、双香豆素、普萘洛尔、地高辛、巴比妥类等,.,利福喷汀（rifapentine）利福定（rifandin）,特点1、抗菌机制、临床应用、不良反应等均同利福