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文档简介

荧光定量PCR,1,-,引物要求：（1）设计的时候尽量靠近基因的3端，这样能最大限度地保证扩增效率（2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染（3）两条引物的Tm值不要相差太大（4）产物长度保证在80200bp之间，最长300bp。（5）避开保守区域,荧光定量PCR引物设计（SYBRGreen）,2,-,1.NCBIPrimerblast,-,NCBI设计引物网址：/tools/primer-blast/,3,-,Primerblast,-,输入基因号或FASTA序列,定义引物的范围（举例：针对长3k的基因，若扩增1000-1050的范围，则可填入Forward1to1000,Reverse1050to3000,若有已知引物，可填入，以测试特异性,针对sybrqPCR：产物大小填100to200（最大不超过300）,可用默认值（最佳Tm为60度，波动范围57to63度，两条引物Tm差值小于3度）,4,-,Primerblast,-,引物是否需跨不同Exon选择1-无所谓选择2-必须跨不同Exon选择3-可以不跨Exon,勾选时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron（当以基因组DNA为模板时）,5,-,Primerblast,勾选时表示要检测引物的特异性,填入要比较的物种（可输入通用名，如human/mouse/rat/rabbit当需要同时比较多物种时，点击”Addmoreorganisms”,勾选”showresultsinanewwindow”-点击”GetPrimers”,6,-,Primerblast结果,7,-,专业的定量PCR设计软件：beaconDesigner1搜索引物保守序列（与转录组比较）,2beaconDesigner设计qPCR引物,黄色区域为相对保守序列，设计引物是要尽量避开,8,-,专业的定量PCR设计软件：beaconDesigner2设计引物,2beaconDesigner设计qPCR引物,9,-,10,-,3qPCR引物特异性验证,1、进入网页：/BLAST/2、点击BasicBLAST中的nucleo
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