免疫检验 第十二章 免疫组化.ppt

第十二章免疫组织化学技术,掌握各种免疫组织化学技术的原理,免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性定位、定量测定的一项免疫检测方法。,根据标记物的性质不同分类：荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术亲和组织化学技术免疫电镜组织化学技术等,第一节免疫组织化学技术要点,活体组织：组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（110.5cm）；取病变组织与正常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织(经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细胞有重叠）各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹水等）。培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。,取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及脱水。,凝固蛋白，终止细胞内酶的作用,防止细胞自溶；固定细胞形态和结构保持组织细胞的抗原性防止细胞层脱落去除细胞内的脂类（妨碍抗体结合）防腐,不损伤组织细胞的固有形态、结构、抗原性和细胞膜的通透性；不干扰固定后的抗原与抗体的识别与结合。,固定时间：一般12小时内，不易超过24小时。,固定剂的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛等（根据抗原的耐受性选择）,缺点：抗原容易被掩盖，特别是甲醛固定后，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。,能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片,石蜡切片：优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。冰冻切片：优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。缺点：不易保存（-800C）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成抗原的弥散使定位不准确。,二、抗原的保存与修复,抗原修复:免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。,常用的方法有：酶消化法：胃蛋白酶、胰蛋白酶和无花果酶盐酸水解暴露抗原法：注意温度和时间微波炉恢复抗原法：微波是一种高频电磁波，可以打开蛋白质之间的交联健，从而使抗原修复。高压锅恢复抗原法煮沸恢复抗原法抗原修复液中的化学成分或离子与部分抗原表位结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。,高温可以使某些已经封闭的抗原表位得以重新暴露和修复,三、抗体的处理与保存,（一）抗体的选择,注意选择具有高特异性、稳定的优质抗体多克隆抗体：敏感性较高、特异性相对较低单克隆抗体：特异性较高、敏感性相对较低,（二）抗体的稀释,抗原抗体反应要比例合适才能达到预期效果使用前根据预实验结果得出抗体的最佳稀释度,（三）抗体的保存,分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低,(三）阴性结果和抗原不表达,（五）免疫组化结果与HE染色结果,(一）必须设立对照,（二）阳性结果,（四）特异性染色与非特异性染色,四、免疫组化的结果判断,确证实验,(一）必须设立对照,对照实验：阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明显示程序正确，尤其实验结果呈阴性时更为重要）阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）,确证实验：空白实验：PBS（排除内源性酶）替代试验：同一动物免疫前的非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗原引起的非特异性反应）（这可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。）吸收或阻断试验：用过量的已知抗原与特异性抗体反应，本已经是阳性的标本应呈阴性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原抗体反应。）,显色分布:,（二）阳性结果,可以作为判定抗原定位的依据,（三）阴性结果及抗原不表达,（四）特异性染色与非特异性染色,特异性染色,非特异性染色,分布在特定的部位，显色不均一,无分布规律，均匀显色,出现假阴性的原因,出现假阳性的原因,（五）免疫组化结果与HE染色结果,五、质量控制,（一）试剂质量控制,抗体特异性、敏感性测试,抗体最佳稀释度的选择,稀释剂,抗体孵育温度、时间非特异性染色：缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。,（二）仪器的质量控制,相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒,（三）操作过程质量控制,操作：步骤是否正确规范；每日之间、操作人员之间的变异；试剂复溶、状态是否良好标本：阴性、阳性或自身组织对照三种类型质控品，可用于监控标本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差,酶免疫组织化学技术酶标记已知抗体（抗原），与标本中靶抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，在显微镜下识别标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。,标本处理与荧光免疫相似标本可长期保存，可用普通显微镜观察,分类,一、组织处理,原理酶直接标记在抗体上，与靶抗原反应，通过酶对底物的特异性催化作用，产生的有色物质沉积在靶抗原部位，从而对靶抗原定位、定性和定量检测。,二、酶标记抗体免疫组化染色,直接法,优点：操作简便、特异性高缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦,底物,间接法,优点：敏感度高缺点：特异性偏低,操作繁琐,底物,原理用酶免疫动物制备抗酶抗体，再将组织抗原与抗酶抗体结合形成复合物，通过酶的底物显色而检测抗原，避免了用酶标记时对抗体的损伤，提高了检测敏感性。,PAP法,酶桥法,双桥PAP法,APAAP法,三、非标记抗体酶免疫组化染色,（一）酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过第二抗体作桥抗体，将结合在组织抗原上的第一抗体与第三抗体连接起来，最后形成酶联的抗原-抗体复合物，底物显色,优点：敏感性比酶标法高缺点：操作繁琐,底物,酶桥法,优点：敏感性较酶标法有所提高缺点：操作分四步，较复杂如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶常被冲洗掉如果酶标记在非特异性抗体上会存在背景着色问题如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗结合，结果就与抗酶抗体竞争桥抗的结合位点，也会影响方法的敏感性,（二）PAP法：是酶桥法的改良法。PAP法将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶形成一种稳定可溶性(PAP复合物),底物,PAP法,第一抗与第三抗的动物种属须相同,操作只需三步PAP复合物稳定，酶不易洗脱，避免了酶桥法的弊端大大减弱背景着色桥连抗体存在的非特异性抗体，因其与第1抗体并非同种属，不能与抗酶抗体结合抗酶抗体中存在的非抗酶抗体，虽可与组织成分结合，但此抗体不能与酶结合，不会有酶活性。,（三）双桥PAP法基本原理:是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上。这种放大方式由于重复使用桥抗体，使桥抗与PAP复合物中的抗酶抗体未充分饱和的Fc段结合，或桥抗体与特异性一抗尚未饱和的Fc段结合。对抗原有明显放大作用，对于组织细胞微量抗原的检测更有实用价值。,底物,双桥PAP法,第一抗与第三抗的动物种属须相同,四、酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物,常用种类:辣根过氧化物酶/HRP底物显色（DAB)棕色或灰蓝色(AEC)最常用碱性磷酸酶/AP底物显色玫瑰红色(-萘酚磷酸盐与快红反应）或深蓝色(-萘酚磷酸盐与快蓝反应）;靛蓝四唑（紫蓝色）最敏感葡萄糖氧化酶/GO底物为葡萄糖，配以NBT和PMS显色蓝色敏感性较低，显色底物不易保存-半乳糖酶等酶的选择:HRP染色结果比AP染色结果保存时间长含有内源性HRP的组织切片:首选标记酶为APAP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记,对比清晰,采用荧光素标记已知抗体（或抗原）作为探针，检测标本中靶抗原（或抗体），在荧光显微镜下，分辨出抗原(或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量。以达到对抗原(或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。,荧光免疫组织化学技术,一、组织的处理,标本的类型：涂片和印片组织切片细胞培养标本活细胞标本的保存：标本固定干燥后，最好立即检测保持干燥、置4甚至-20以下保存,二、荧光免疫组化染色,直接法：优点：操作简便、特异性高缺点：敏感度偏低、抗体制备麻烦,间接法：优点：较直接法灵敏，标记一种抗体可以鉴定多种抗原缺点：非特异荧光、操作时间较长,双标记荧光免疫染色法用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本中的相应两种抗原同时检测,亲和组织化学（Affinityhistochemistry）,利用两种物质之间的高度亲合力而建立的一种方法。一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素（与蛋白糖基）、生物素（亲和素）和葡萄球菌A蛋白（IgGFC段结合）等，都对某种组织成分具有高亲和力的特点，可以与标记物如荧光素、酶、同位素、铁蛋白及胶体金等结合,可采用荧光显微镜、酶加底物的显色反应、放射自显影或电子显微镜，在细胞或亚细胞水平进行对应亲和物质的定位或定量。,原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化抗体相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。,（一)亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术ABC,ABC间接法原理示意图,待测抗原非特异性抗原,A-亲合素B-生物素E-酶,原理：预先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合形成可溶性的ABC复合物。当其与检测反应体系中的生物素化第二抗体相遇时，ABC中末饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与ABC标记体系连成一体进行检测。,缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理ABC复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合，亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合,优点：敏感性高特异性高一抗和二抗工作浓度低操作时间缩短可以多重标记,(二）桥联亲合素-生物素技术BridgedAvidin-Biotintechnique，BRAB,原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素(酶标生物素)联结起来，达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。,（三）标记亲和素-生物素技术LabelledAvidin-biotintechnique，LAB,原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点:相当高的灵敏度，省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。间接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高检测灵敏度,二、葡萄球菌A蛋白法,定义:葡萄球菌蛋白A/SPA是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物（人、猪、兔、小鼠等）IgG的Fc段结合，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验,注意：SPA对IgG亚型的结合有选择性（如IgG3不结合），不结合IgA1,可能出现的假阴性结果。,优点：解决不同动物样本检测时，需分别标记相对应的二抗的问题。,三、凝集素法,凝集素lectin是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素，凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具，凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲合反应,直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。,间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应。糖-凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”的结合物。,四、链霉亲合素-生物素法(LSAB）,链霉亲合素(StreptavidinSA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法,LSAB法具有几大特点：可结合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过ABC法低背景着色操作时间缩短,免疫电子显微镜（ImmunoelectronMicroscope，IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物，在电子显微镜下对高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。特点:定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点,一、免疫标记电镜技术的原理,标本制备的要求是保存良好的细胞超微结构，注意保持组织的抗原性，因此在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。,二、免疫标记电镜技术标本的制备要求,从动物到电镜照片,（）免疫胶体金染色法,免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体检测的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成为特定大小的金颗，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。它在弱碱环境下可与蛋白质分子形成牢固的静电结合而不影响蛋白质的生物特性。,三、常用的免疫标记电镜技术,免疫金银法(ImmuNogoldsilvertechNiqueIGST)。其基本原理是用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体，再与特异性抗体结合，用乳酸银处理，使银颗粒沉积在金颗粒上，还原银反应而显示出黑褐色。适用于石蜡切片，冰冻切片，培养细胞，细胞涂片和树脂包埋的电镜切片，该法敏感性高，可检测组织中微量抗原，定位准确，无扩散现象，背景清晰，对比度好，方法简便。,免疫金银染色直接法原理示意图,分类：按染色步骤直接法间接法按标记与包埋的关系包埋前标记法：抗原活性保存较好，标记率较高包埋后标记法：可对一个材料反复进行标记，试剂用量少,前列腺内分泌-旁分泌细胞免疫胶体金染色显示有降钙素的沉积,应用：细胞表面成份的研究胶体金技术与冷冻蚀刻技术结合-细胞膜蛋白颗粒或其它膜成份进行精细定位电镜原位杂交技术，能够在超微水平上精确定出基因位点,（二）免疫胶体铁细胞化学染色法,胶体铁是一种阳离子胶体，