实验五-粪标本的微生物学检验PPT课件

实验六,粪便标本的微生物学检验,1,-,实验目的：掌握粪便标本的采集与处理、常见病原菌及一般微生物学检验程序。掌握沙门氏菌和志贺氏菌的鉴定方法；熟悉它们的生物学性状。,2,-,粪便标本的采集与处理：自然排便采集法：自然排便后，挑取粪便23克于无菌的容器内送检。应尽可能取有脓血、粘液的标本。肛拭子法：不易获得粪便的患者或作厌氧菌培养时，常采用此法。将无菌棉拭子用无菌生理盐水湿润后，插入肛门约45厘米（幼儿约23厘米）处，轻轻旋转，擦取直肠表面粘液后取出，置无菌试管内送检。除婴幼儿外，不推荐用棉拭子做常规病原菌培养。疑似痢疾患者应在发病初期、用药前采取标本；疑似伤寒患者应在发病23周内采集粪便标本。若疑为霍乱患者，标本应置碱性蛋白胨水中。若疑有耶尔森菌或弯曲菌等，标本应置卡布运送培养基送检。粪便标本如不能立即送检，可将标本放入甘油盐水保存液中或保存于冰箱内（勿超过2h）,3,-,粪便标本中常见的病原微生物,4,-,粪便标本的检验程序,粪便标本或肛拭子标本,直接涂片革兰染色抗酸染色,分离培养（SS、MaC、TCBS、碱性蛋白胨平板）,增菌培养（GN增菌、亚硒酸盐增菌液、碱性蛋白胨水）,351824h,菌落形态、革兰染色,氧化酶试验,KIA、MIU及其他生化反应、血清学凝集、药敏试验,报告结果,5,-,注：GN增菌液、亚硒酸盐增菌液用于志贺菌、沙门菌的增菌。直接涂片只适应于疑为霍乱、肠结核及伪膜炎肠炎患者。,GN增菌液：本培养基含有胆盐、枸橼酸盐对革兰氏阳性菌有抑制作用，而对革兰氏阴性菌有增菌作用，接种标本6小时内，大肠杆菌、变形杆菌及假单胞菌在此培养基中生长迟缓，而志贺菌、沙门氏菌生长较迅速。故常于接种粪便68小时，再自此增菌液内接种至SS平板、MaC平板中。,6,-,亚硒酸盐增菌液：本培养基中的04%亚硒酸钠可抑制革兰氏阳性菌的生长，对革兰氏阴性菌也有毒性，但磷酸钠有中和此毒性的作用，能使肠道致病菌迅速繁殖。磷酸氢二钠与磷酸二氢钠有缓冲作用，有利于肠道致病菌生长。,7,-,SS平板：是专用志贺菌、沙门菌分离培养用的一种强选择性培养基。胆盐能抑制革兰氏阳性菌生长，煌绿抑制大肠杆菌的生长。促进志贺菌、沙门菌生长（对胆盐和煌绿等染料有抵抗力）。胆盐、枸橼酸钠及硫代硫酸钠在一定比例时发挥联合抑菌作用。硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺菌、沙门菌的有害作用并中和煌绿、中性红的毒性作用。本培养基除抑制肠球菌、革兰氏阳性菌外，还可抑制大部分大肠艾希氏菌、产气肠杆菌等革兰氏阴性菌，对志贺菌、沙门菌也有轻度的抑制作用。由于该培养基抑制杂菌的能力强，故可以增加粪便接种量而获得较高的阳性分离率。,8,-,实验器材：1、标本：已增菌模拟粪便标本1#、2#、3#、4#、5#。2、培养基：SS、MaC、KIA、蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水、甘露醇半固体培养基。3、试剂：革兰染液、氧化酶试剂、3%H2O2、靛基质试剂、甲基红试剂、10%FeCl3、硝酸盐还原试剂甲液、硝酸盐还原试剂乙液。4、诊断血清：志贺菌属：志贺菌四种多价诊断血清、福氏志贺菌多价诊断血清、宋内氏志贺菌单价诊断血清。沙门菌属：AF群多价O血清、O因子血清（O2、O4O9）、H因子血清（HaHbHd）、Vi血清。,9,-,实验方法：一、分离培养用无菌方法将1#、2#、3#、4#、5#模拟粪便标本分别划线接种于SS、Mac上，置35培养1824小时。,10,-,二、结果观察：、菌落形态描述:分别描述1#、2#、3#、4#、5#标本在SS、Mac上的菌落形态。（可疑菌落与正常菌群菌落分别描述）2、革兰染色：3、触酶试验：4、氧化酶试验：5、细菌分纯：挑取生长于SS平板、MaC平板中的可疑菌落35个分别接种35支KIA。37培养1824小时后，观察结果。,11,-,三、KIA结果观察,分别描述1#、2#、3#、4#、5#标本的KIA结果。,四、生化反应：根据KIA的结果进一步做生化反应。从KIA斜面上挑取1#、2#、3#、4#、5#标本细菌分别接种于蔗糖半固体发酵管、蛋白胨水、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水，37培养1824小时后，观察结果。,12,-,五、血清学试验:沙门菌属：如生化反应符合沙门氏菌属，则可按下述步骤进行血清学诊断：1、先用AF群O多价血清作玻片凝集试验（做生理盐水对照,看有无自凝）2、AF群O多价血清凝集则用O因子血清定群：O抗原有许多组成成分，有的是一种菌所独有的，有的是几种菌共有的。将具有相同菌体抗原的沙门氏菌归属于同一组（群）。故O因子血清只能定群。3、AF群O多价血清不凝集，做Vi因子血清凝集。如果凝集，需用生理盐水制成浓稠菌悬液后隔水煮沸1530分钟，再做凝集试验。（新分离的伤寒及丙型副伤寒常带想此抗原。）4、按照确定的O群分别用H因子血清检查H抗原。,13,-,志贺菌属：若生化反应结果相符，则作玻片凝集反应：1、做生理盐水对照,看有无自凝。2、用志贺氏菌属4种多价血清反应，若有凝集，再用单价群诊断血清（福氏志贺菌多价诊断血清、宋内氏志贺菌单价诊断血清）行凝集反应定群。血清学试验结果判断：血清凝集试验阳性：出现肉眼可见凝集颗粒血清凝集试验阴性：液体呈乳状悬液,14,-,六、实验结果：,1、KIA结果：,2、生化反应结果：,15,-,血清学试验结果：,沙门氏菌血清学试验结果记录,志贺氏菌血清学试验结果记录,16,-,结果报告：1