血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验报告

生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期1、 实验目的1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法；1.2.了解电泳技术的一般原理；1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。二、实验原理2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5条区带。2.2.血清中不同蛋白质的等电点、分子量及含量血清蛋白质 等电点 分子量 占总蛋白的 清蛋白 4.64 69,000 5772 1球蛋白 5.06 200,000 252球蛋白 5.06 300,000 49 球蛋白 5.12 90,000150,000 6.512球蛋白 6.857.3 156,000950,000 1220缓冲液pH=8.6，pIpH。血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。预测血清蛋白电泳区带图血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的1、2、五个区带2.3.膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带；各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。三、材料与方法：3.1.实验材料：3.1.1.实验试剂：样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）；氨基黑10B染色液；漂洗液；洗脱液：0.4mol/NaOH溶液。3.1.2.实验器材：V-1100分光光度计（1）；恒温水浴箱（1）；试管（6）、试管架（1）；1000L加样枪（1）、加样枪架（1）；醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120m）；培养皿（5）；点样器或载玻片（1）；平头镊子（2）；剪刀（1）；电泳槽（1）；直流稳压电泳仪（1） 3.2.实验步骤1 准备与点样：取28cm的膜条；亚光面距一端1.5cm处取一点样线；充分浸透在巴比妥缓冲液中；取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；点样器下端粘上薄层血清；垂直点样。点样示意图：注意：点样线尽量点得细窄而均匀。 +8cmm2cm点样线点样区1.5cm(粗面） 小组标记 样品标记2. 电泳：放置膜条（点样面向下，点样端置于阴极）；膜条贴紧滤纸，拉直膜条；平衡五分钟；通电（调节电压120v/电流，时间：4560 min）；关闭电源。电泳槽解剖图： 3.染色、漂洗：通电完毕；取出膜条；浸于染色液（氨基黑10B）中，5min；取出膜条，浸于漂洗液；反复漂洗2次，直至漂净；滤纸吸干薄膜。 4.定量（洗脱比色法）（因实验室等原因，未做）四、结果与讨论： 图一 染色后的膜条4.1.结果分析本次实验得到的图谱只能够清晰的看出清蛋白和球蛋白的区带，其余无法区别。原因可能如下：醋酸纤维薄膜质量不足薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。点样太少，区带显色不明显。电泳时间不足。薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足。取出电泳后的薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。染色时，因为现场混乱，可能导致醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。4.2.课后思考题1. 电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？答：点样端置于电场的负极。因为人体血清的蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质，理应将点样端置于电场的负极。2. 电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。答：醋酸纤维薄膜质量不足；薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带；点样太少，区带显色不明显；染