基因芯片在肿瘤研究中的应用

肿瘤基因组学与基因芯片,第十讲,肿瘤的研究,美国1971年颁布国家癌症条例开始抗癌大战使癌症成为“慢性病”,ConceptofNeoplasm（瘤）,“isanabnormalmassoftissue,thegrowthofwhichexceedsandisuncoordinatedwiththatofthenormaltissues,andpersistsinthesameexcessivemanneraftercessationofthestimuliwhichevokedthechange”,Willis,1952,BasicBiologicFeaturesofNeoplasms,OncogenicLesion(e.g.RAS,MYC,E2FActivation),Differentiation,AbnormalProliferation,Angiogenesis,Invasion,Senescence,Apoptosis,NeoplasmsEvolveinMultipleSteps,Initiation:presumablyoccursthroughirreversibleorstabledamagetoDNAPromotion:anprocessbringingaboutaclonalexpansionofinitiatedcellsProgression:resultswhengeneticinstabilityleadstofurthermutagenicandepigeneticchanges,肿瘤的发生（Initiation）,Tumorinitiation：CooperativeDNAlesionsascommonfinalpathwayPrecancerousandincipient（初始的）lesionsMoleculartargets：Oncogenes,tumorsuppressorgenesgreen,down-regulatedmiRNA;black,nodifference).,PCRArraysarethemostreliabletoolsforanalyzingtheexpressionofafocusedpanelofgenes.Each96-wellor384-wellplateincludesSYBRGreen-optimizedprimerassaysforathoroughlyresearchedpanelofrelevant,pathway-ordisease-focusedgenes.PCRArrayscanalsobecustomizedtocontainapanelofgenestailoredtoyourspecificresearchinterests.,比较基因组杂交芯片CGHarray,杂合性缺失（lossofheterozygosity）,杂合性指同源染色体中不同等位基因存在于一个或多个基因位点中的现象；野生型拷贝或等位基因发生缺失就称为杂合性缺失（LOH），LOH通常是由染色体缺失或重组引起。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段丢失。杂合性缺失在肿瘤细胞中是一种非常常见的DNA变异。,肿瘤中存在基因的扩增通过比较肿瘤组织与体细胞组织中野生型和突变DNA的比值可以检测LOH以及基因的扩增；,比较基因组杂交（comparativegenomichybridization，CGH）,一种分子细胞遗传学技术，能够通过一个简单的杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝数改变。主要原理是采用经过荧光标记的肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA为探针，与正常人中期染色体标本进行原位杂交，根据两种探针荧光信号的强度差异找出基因组中DNA的增加或缺失区域。,aCGH(ArrayComparativeGenomicHybridization),比较基因组杂交（简称CGH）的方法被用来监测染色体基因组的改变。CGH最突出的优点在于：通过一次实验就能完成对整个基因组中所有遗传物质增加或丢失的分析，实验所使用的DNA可以是从新鲜冻存的组织中提取的，也可以提取自福尔马林固定石蜡包埋的保存材料。CGH主要用于肿瘤细胞染色体DNA片段的缺失和增加的检测,同时对其它与染色体拷贝数变化有关的疾病也能进行分析和检测，如小儿自闭症，先天性发育迟缓等一系列遗传病症。,ArrayCGH就是一种新的用于检测肿瘤细胞染色体拷贝数变化的技术，该项技术能够通过一个简单的杂交反应检测出整个基因组DNA拷贝数改变。主要原理是采用经过不同颜色荧光标记的肿瘤基因组DNA和正常基因组DNA与芯片上结合的覆盖全部人类基因组的寡核苷酸探针杂交，根据杂交后两种探针荧光信号的强度差异找出基因组中DNA的增加或缺失区域。aCGH的特点:高通量（覆盖人类全基因组的探针设计，包括针对基因外显子、内含子和基因间序列的探针，一张芯片上探针的数量接近24万个探针），高分辨率（24万个探针的平均分辩率在6.4KB,对目前较为了解的基因来说，可以检测到这些具体的基因的单个拷贝数的变化Agilent，Nimblegen分辨率为6KB）。,利用基因芯片并行检测前列腺癌染色体畸变和基因表达谱,研究所用48例前列腺癌样本和10例正常样本（9例前列腺组织和1例肾脏组织）由北京大学附属第一医院提供,11例前列腺癌样本同时进行了表达谱和CGH实验。,芯片类型：博星基因芯片有限公司的8000点的基因芯片（cDNA芯片）,整合分析11例前列腺癌样本同时进行了表达谱和CGH实验。我们对这11个样本的每个样本计算了余弦相关系数以考察CGH和表达谱的一致性。为了寻找表达受到染色体畸变影响的基因，挑选处于染色体扩增区（在10%的18例前列腺癌）的表达上调（在25例前列腺癌）的基因和处于染色体缺失区（在10%的18例前列腺癌）的表达下调（在25例前列腺癌）的基因。对每个挑选出来的基因计算了Jackknife相关系数来评估其表达水平和DNA拷贝数的关系。,53个基因表达可能受到染色体畸变影响,本研究发现的常见染色体畸变区域大部分在以前的研究中报道过，但是与前人的研究结果相比也存在畸变区域和畸变频率方面的一些差异。究其原因，可能有如下几个方面：运用不同的实验手段、不同的分析算法和不同的判断标准都有可能造成研究报道之间的差异；前列腺癌存在种族差异。发现新的染色体畸变，如Xq21.33-q22.2。,染色体畸变是一个很重要的癌变机制，可能导致位于其上的原癌基因激活或者抑癌基因丢失。我们的研究发现基因表达水平和染色体拷贝数呈弱的正相关。余弦相关是线性相