金属β-内酰胺酶综述

金属类-内酰胺酶-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属-内酰胺酶（metallo-lactamase,MBL），简称为金属酶。金属-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属-内酰胺酶。底物为包括碳青霉烯类在内的一大类-内酰胺抗生素，其活性不被常见的-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。金属-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。这些酶都由染色体基因编码。该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。1991 年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21)，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP218 和VIM213，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。二、生化分类和生化性质1995 年Bush 等将金属酶全部归入功能类型3群,主要分类依据为：能被金属螯合剂螯合，不被-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制。当时没有再作进一步分类。随着金属酶报道的增多，1997 年Rasmussen 和Bush 将金属酶按功能分成三个亚群：3a、3b 和3c 。1) 3a 亚群 绝大多数金属酶属于3a 亚群。其特点是底物谱宽，水解青霉素的速度与水解亚胺培南的速度相近或更快，还能有效水解头孢菌素，因此，3a亚群金属酶是-内酰胺酶中最危险的单一酶种。许多3a 亚群酶需添加Zn2+ 才能达到最大活性或被激活，提示该亚群与Zn2+的亲和力低。2) 3b 亚群 分布于气单胞菌中，包括亲水气单胞、杀蛙气单胞、温和气单胞和简达气单胞菌。特点是底物特异性高，优先水解碳青霉烯，弱水解青霉素(A2h 除外) 和头孢菌素，不水解nitrocefin ，因此不能用nitrocefin 纸片法检出。等电聚焦电泳和凝胶柱层析时必须用亚胺培南作底物才能检测到。能被EDTA抑制，加EDTA 后，再加Z2+ 又可恢复酶活性。高浓度Zn2+ 可增加酶活性而在低浓度时酶活性受抑制。当Zn2+ 在15mol 或更低时，至少有3 种3b 酶的活性受抑制。3) 3c 亚群 只有一种，来源于戈氏军团菌，至今尚未命名。能高效水解头孢菌素，弱水解碳青霉烯类。这三群金属酶不水解氨曲南，不被克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦抑制,水解较新的碳青霉烯的能力比水解亚胺培南弱(3a 亚群的Bacill us cereus 和3b 亚群的AsbM1除外) 。三、金属酶的分子生物学亚型分类法及分子生物学特点 Philippon等研究了金属酶的基因编码序列的多样性，根据其序列相似度的类型，将金属酶a，b两个亚群又进一步细分为个亚类：B1、B2、B3。1）B1亚群：包括了绝大多数已知的金属酶，蜡样芽胞杆菌产生的酶 （），脆弱拟杆菌产生的 CcrA（又名CfiA），脑膜炎败血黄杆菌产生的酶 BlaB，吲哚黄杆菌产生的IND-，在铜绿假单胞菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌中发现的IMP类以及VIM类都属于该亚型。 酶分子量在28kD左右，其氨基酸同源性23%，有3个组氨酸和1个半胱氨酸残基参与活性部位Zn2+和或水分子的结合，其活性都能被EDTA所抑制，加入Zn2+后能恢复活性，大多数由质粒介导。B1亚群金属酶都含有与酶的活性基团相关的3个组氨酸和一个半胱氨酸。 （2）B2亚群：包括气单胞菌金属酶CphA、CphA2 及Imis和居泉沙雷菌产生的SFH-。本亚群与B1亚群的分子大小相近，但同源性低，两亚群间仅23个氨基酸相同（约11）。 只有一个 Zn2+活性位点，以碳青霉烯类作为底物。（3）B3亚群只有一个来源于嗜麦芽窄食单胞菌的L1酶。本亚群酶只有9个氨基酸与其它金属酶相同。L1酶的结构是四聚体，与其它金属酶显著不同（其它金属酶都是单体）。来自不同菌株的L1等电点（pI）不同，表明L1可能是一大家族。 军团菌的FEZ-1 酶是该亚型的新成员，与 L1有29.7%的氨基酸同源性，结合Zn2+的残基也相同 （ His87，His86，Asp88，His89，His160，His225）。 四、MBL的分子结构特点很长一段时间以来，MBL在临床上没有得到足够的重视，但随着 MB L的广泛的扩散， 越来越多的研究者在 MBL的产生、流行、治疗演变、结构和机制上加以深层次的研究。由于带 M B L的细菌对所有已知的碳青霉烯类抗生素耐药，因此，研究者集中于MBL的三维结构和其与相应的靶蛋白结合机制，为探寻有效的MBL抑制剂以应用于临床。金属酶由一大群遗传异质性的酶类组成，虽然一级结构显示很低的同源性（经常 40%，有时甚至不到），但是它们的三维结构(酶蛋白形成的立体结构)却显示很高的相似性都表现为/ 夹心结构，该结构可分为2个半球，2个半球结构相似，各有一个金属离子。提示它们在进化上是相关的，但进化途径与丝氨酸活性-内酰胺酶不相同（丝氨酸活性-内酶胺酶进化于青霉素结合蛋白 PBPs）。金属酶中的关键残基，尤其是形成金属键的氨基酸残基高度保守，都有一个HXHXDHZn2+ 保守序列。酶的活性部位存在一个氢氧根离子和1 2个锌离子，氢氧根离子由水分子与金属酶肽链第90位的天冬氨酸残基（Asp90）相互作用产生，作为2个锌离子之间的桥联配体。 酶分子中存在2个锌离子结合位点：第1个结合位点中与锌离子结合的配基由组氨酸His86，His88，His149和水分子提供；第2个结合位点的配基由 Asp90、Cys168 以及His210提供。它通过半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸等活性位点的氨基酸与锌结合，再结合水分子使其活化，成为亲核试剂，对-内胺类抗生素具有广泛的水解作用，导致对头孢菌素、碳青霉烯类抗生素等产生耐药。五、金属酶的分子生物学基础金属酶又分为先天型和获得型。 先天型金属酶又称为天然金属酶，其基因稳定地镶嵌在宿主染色体中。 20世纪90年代以前报道的金属酶均为染色体编码，不能转移，其基因的表达可为诱导型，也可为非诱导型。 有 L1、BlaB、GOB、IND-1、CGB-1、TUS-1、MUS-1、JOHN-1、EBR-1、Bc、CfiA或CcrA、CphA、THIN-B、SFH-1、FEZ等。 存在于临床罕见的细菌中（芽胞杆菌属、气单胞菌属、黄杆菌属），一般一种酶基因只被一种细菌所携带，且这些菌属的产酶菌比例也较小，携带金属酶的细菌也一般不致病，引起严重感染的罕见。 在脆弱拟杆菌中还发现了沉默型金属酶基因，在正常情况下不表达或低水平表达，对亚胺培南敏感，可因暴露于碳青霉烯类抗生素，操纵子基因发生突变或在操纵子SD序列上游插入插入序列（insertionsqeuence,IS）而使金属酶高水平表达，IS提供持续高水平转录所需的转录起始信号。近来发现铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、黏质沙雷菌和其他肠杆菌属类如：大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、弗氏构椽酸菌等均可产生获得性金属酶。 获得性金属酶主要分布于铜绿假单胞菌和不动杆菌属中，通过质粒或类整合子介导进行水平传播，已在美洲、欧洲和东南亚发现。 获得性金属酶相较检出数量多，分布的菌属和地域广泛，是临床关注的热点。 迄今为止发现的细菌的获得性金属酶有5类基因型：IMP、VIM、SPM和GIM、SIM，其中最主要的IMP和VIM，根据基因和翻译的氨基酸序列不同分为很多亚型，现已发展到IMP-22 和VIM-12。 除少数IMP型位于型整合子、少数金属酶通过可移动的共同区域（CR）进行转移外，大多数金属酶位于型整合子中。六、检测方法 金属酶目前还没有一个标准的表型检测方法，检测标准同样是依靠该菌是否携带 MBL相关基因来确定。目前常用的金属酶的检测方法类似于其它MBL的检测方法，以十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 确定分子量，等电聚焦测定等电点，根据酶对不同底物的水解能力确定其酶的性质及底物轮廓。检测金属酶的关键是将其与底物轮廓相似的丝氨酸内酰胺酶(如 Amp C酶) 区分开来。国内外已有较多关于金属酶检测方法的报道，但目前国际上仍没有推荐方法。但两种酶抑制剂同时使用可以使对各种金属酶不同结构活性中心的抑制作用相互弥补，提高检出率。金属酶由于其独特的作用机制，使其几乎能水解现有的各类 内酰胺抗生素