大肠杆菌感受态细胞的制备PPT课件

大肠杆菌感受态细胞的制备，实验目的，1。熟悉感受态细胞的制备原理。2.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。根据实验原理，在自然条件下，许多质粒可以通过细菌接合转移到新的宿主。然而，在人工构建的质粒载体中，这种转移所需的基因通常是缺乏的，因此从一个细胞到另一个细胞的接合转移不能单独完成。如果质粒载体需要转移到受体细菌中，则需要诱导受体细菌产生瞬时感受态以摄取外源DNA。通过一定的物理和化学方法诱导后，适合吸收和含有外源DNA的细胞称为感受态细胞。目前，制备感受态细胞已经成为基因操作的常规技术。感受态细胞：原核细胞或真核细胞。特点：在制备过程中，细胞的渗透性增强，使其易于接受外源基因。细胞本身应该是一种修饰和限制酶缺陷的菌株，这样外来的DNA分子就不容易被切除或破坏。感受态细胞的制备可以使用电击或化学方法。电击法是用瞬时高压电流处理细胞悬液，使细胞膜去极化，产生微孔，使悬液中的核酸通过微孔进入细胞。电击转化需要仪器来帮助简化化学规则，特别是适合原核细胞能力的制备。感受态大肠杆菌的制备：氯化钙法的原理是细胞在低温和低渗透性氯化钙(0.1M)的作用下膨胀。Ca2使细胞膜中的磷脂双层形成液晶结构，这促进外膜和内膜之间间隙中的部分核酸酶解离并诱导细胞成为感受态细胞。在转化过程中，混合物中的脱氧核糖核酸形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，并附着在细胞表面。通过热刺激，在液晶细胞膜表面产生裂缝，使外源性DNA进入细胞。操作步骤：细菌接种培养取-70冷冻大肠杆菌DH5菌株，用划线法接种细菌于培养皿中，标记好，37培养过夜。第二天，从平板上挑选一个菌落，接种到含有3mlLB培养液的试管中，并在37下振荡培养过夜。第二天，将30L的细菌溶液接种到含有3mlLB培养基的试管中，在37下剧烈摇动培养约2-3小时(200-300 r/min)。当菌落600毫摩尔达到0.30.4时，取出试管，置于冰上1015分钟。在无菌条件下，取1毫升菌液，放入1.5毫升离心管中。在4下以5000转/分的速度离心5分钟。弃去上清液，将试管倒置在干燥的滤纸上1分钟，并将残余培养液吸干。(1)在离心管中加入200L预冷的0.1毫升冰，摇匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。(2)4离心。以5000转/分钟的速度旋转5分钟，弃去上清液，将试管倒置在干燥的滤纸上，吸出残余液体。(3)加入50L 0.1M的冰预冷氯化钙，使菌体重新悬浮，并在4下保存备用。2448小时效果良好。如果暂时不使用，可以加入30%等体积的甘油(甘油的最终浓度为15%)，并混合均匀。液氮速冻后，可在-80的低温冰箱中保存半年以上。注意，细胞的生长状态和密度优选直接从甘油保存的菌株在-70或-20转移到细菌液体中以制备感受态细胞。请勿使用已转移多次或储存在4的培养液。对数生长期或对数生长期的细菌应用可以通过测量培养液OD600来控制。当DH5菌株的OD600为0.5时，细胞密度约为5107细胞/毫升，过高或过低都会降低转化率。防止污染的整个操作过程应在无菌条件下进行。所用的容器，