口腔上皮细胞原血红素检测

口腔上皮细胞原血红素a/b/c检测（苯胺蓝染色液）,口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一，包括口腔癌按其发生部位可分为龈癌、唇癌、颊癌、舌癌、口底癌、腭癌、上颌窦等。国内文献报道口腔癌的发病率为1.061.69/10万人口。口腔癌占全身恶性肿瘤的1.93.5%，占头颈部恶性肿瘤的4.720.3%。相比其他部位的癌症，口腔癌更易转移、治疗花费大、预后差，目前健康，甚至生命。因此，口腔癌的预防就显得十分重要。从早期发现入手，口腔癌是可以预防的。,既往口腔癌的筛查方法主要依赖肿瘤标志物癌胚抗原（）检查，但特异性很差。检查和细胞学检查不适于筛查或早期诊断。研发敏感性高、特异性强、经济便捷的口腔癌筛查方法非常迫切。,苯胺蓝染色液（口腔细胞特殊染色TNOSSF-2型）是一种分析口腔上皮组织细胞病理变化的检测试剂，属液体活检病理学检测技术，应用于口腔癌筛查及协助早期诊断。该产品为无创取材、靶向、快速、自动化分析和/或床旁（POCT）诊断，510分钟即可显示检测结果。具有新颖性、创新性、实用性，高灵敏度、高特异度，准确、快速、经济、操作方便。独家研制、专利产品，是口腔癌筛查、普查和协助早期诊断的适宜技术。,【操作方法】1、全面的检查需要良好的照明，压舌板，手套和纱布垫。口镜或咽喉镜有助于口腔检查。依次检查牙、牙龈、口腔黏膜、舌、唾液腺导管口及软硬腭。应注意其形态、颜色、质地的变化，包括有无肿胀、增生、萎缩、点彩消失等；上皮覆盖是否完整，有无疱疹、丘疹、糜烂、溃疡、过度角化、瘢痕、肿块及色素沉着；是否有出血；挤压腮腺或下颌下腺时导管口处有无涎液流出及涎液的情况。若发现异常，用采样拭子在局部擦拭，取得口腔黏膜渗液和分泌液。一般取液量为0.51ml，以棉拭子头部全部湿润为度。2、取得口腔黏膜渗液和分泌液后，打开样本管（红塞），把拭子头部置入样本液内充分搅动，使蘸在上面的液体与样本保存液混匀制得样本液。,【注意事项】1、正确取材是准确检测的前提和保证，全面、认真检查口腔各个部位，发现细微的异常，以使苯胺蓝染色液体活检病理学检测技术成功实施。2、苯胺蓝染色液体活检病理学检测技术是一项靶向检测技术，取材部位与检测结果具有组织器官的一致性。3、本检测为筛查方法，检验结果仅为提示性资料，为评估口腔恶性肿瘤患病风险提供参考，请结合临床进一步检查作出疾病判断。4、口腔内出血性疾病容易造成假阳性，应结合病史、体征及其它检查进行鉴别诊断。,技术原理,肿瘤细胞Warburgeffect,高耗糖（10倍以上）糖酵解活跃三羧酸循环抑制,Pasteureffect,Warburgeffect,氧化磷酸化与糖酵解相互调节，动态平衡,肿瘤细胞,正常细胞在氧充足的情况下，利用线粒体的氧化磷酸化产生为细胞的生命活动提供90%ATP。在氧不足的情况下，细胞能量转变为糖酵解（无氧糖酵解和磷酸戊糖途径）的方式。有氧状态下氧化磷酸化对糖酵解有抑制作用，称为Pasteur效应。,诺贝尔奖获得者德国生物化学家奥托.海因里希.瓦博格（OttoHeinnichWarburg）发现肿瘤细胞的耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。肿瘤细胞主要通过磷酸戊糖途径产能，即便在有氧情况下，氧化磷酸化反应也不能对糖酵解产生抑制作用。这称为瓦博格氏效应（Warburgeffect）。,FDG-PET/CT的设计原理肿瘤细胞糖代谢异常Warburgeffect,恶性肿瘤细胞由于代谢旺盛，导致对葡萄糖的需求增加，因此静脉注射葡萄糖类似物18FDG后，大多数肿瘤病灶会表现为对18FDG的高摄取，因此可应用18FDGPET-CT显像可早期发现全身肿瘤原发及转移病灶，准确判断其良、恶性，从而正确指导临床治疗决策。,PET-CT运营成本相当高，进口价格两千多万人民币，再加上人员、维护费等费用，成本在3000万元左右。但很多医院一年即收回成本。PET-CT全身检查一次,辐射量相当于一个正常人30年的辐射，一小时就接受。相当于在日本福岛核电站泄漏的第二天站了一天。2011年底，卫生部在一份文件中提出要规范使用PET-CT，要求其检查阳性率不低于70。这一表态意味着PET-CT今后必须对症使用。,为解决PET-CT运营成本高、对人体有较重的辐射危害问题，我们根据同一原理，即肿瘤细胞糖代谢增高（瓦博格氏效应）设计出一种简便易行、安全无创的恶性肿瘤筛查和早期诊断的方法，称为PrettyPositronEmissionTomographyofTube。,P-PET精巧的试管PET苯胺蓝染色液PrettyPositronEmissionTomographyinTube,磷酸戊糖途径,肿瘤细胞瓦博格氏效应（Warburgeffect）：糖代谢异常1、耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。2、磷酸戊糖途径活跃。,恶性肿瘤细胞糖酵解代谢活跃的机制较为复杂，目前尚未完全明确。主要包括以下几个方面的因素:1、原癌基因的激活（低氧诱导因子hypoxia-inducedfactorHIF的激活导致肿瘤细胞糖酵解增加；丝苏氨酸蛋白激酶PI3KAKT信号转导通路激活刺激糖酵解）；2、肿瘤抑制基因的失活（p53调节细胞能量代谢）；3、低氧微环境；4、糖酵解调节机制异常。5、线粒体氧化磷酸化功能的损害等。,肿瘤细胞糖代谢关键蛋白及酶学变化,1、肿瘤细胞摄取葡萄糖能力是正常细胞的10倍左右，肿瘤细胞膜表面存在大量葡萄糖转运体（GLUT）。大量恶性肿瘤GLUT3，GLUT4过量表达，GLUT1在正常组织中表达，在恶性肿瘤组织中表达增高。,2、在肿瘤细胞中，氧化磷酸化的酶合成受到抑制，如细胞色素C，丙酮酸脱氢酶系复合体、琥珀酸脱氢酶，延胡索酸水和酶等；,3、糖酵解酶合成增多，例如己糖激酶（HK），6-磷酸葡萄糖脱氢酶，磷酸果糖激酶、乳酸脱氢酶和磷酸甘油醛脱氢酶等。,磷酸戊糖途径,葡萄糖转运蛋白,己糖激酶,6-磷酸葡萄糖脱氢酶,丙酮酸脱氢酶系,中国科学技术大学生命科学学院吴缅教授和美国宾夕法尼亚大学医学院杨小鲁教授的合作研究结果认为，这种肿瘤细胞代谢异常与抑癌基因p53突变有关。在正常状态下，阻抑蛋白p53与磷酸戊糖途径上第一步反应的关键酶“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”相结合，抑制它的活性，阻止磷酸戊糖旁路的进行，确保正常状态的细胞中主要通过三羧酸循环途径进行能量代谢。,阻抑蛋白p53+葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,p53,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,葡萄糖,丙酮酸,乙酰辅酶A,三羧酸循环,ATP二氧化碳水,葡萄糖,戊糖磷酸代谢途径,NADPH,果糖-6-磷酸,二氧化碳,Warburg效应,Pasteur效应,3-磷酸甘油醛,抑制,己糖激酶,己糖激酶,丙酮酸脱氢酶系复合体,HIFPI3KPI3KKT,GLUT,Ferton氏反应,Fe2+H2O2Fe3+OH-+OH,芬顿（Ferton）氏反应，是H2O2与线粒体内的功能性二价铁离子反应产生活性氧（ROS，reactiveoxygenspecies）的反应。1mol的H2O2与1mol的Fe2+反应后生成1mol的Fe3+，同时伴随生成1mol的OH-外加1mol的羟自由基。在pH4的溶液中，羟自由基的氧化电势高达2.73V。另外，还生成1mol的过氧自由基。,羟自由基的氧化态势仅次于卤族元素氟。但是，羟自由基半衰期短（不到1s），作用直径很短（3nm）。因而最邻近羟自由基的部位受到攻击的可到性最大。线粒体内膜裸露于内膜上氧化呼吸链产生的大量自由基的环境中，所受氧化损伤最严重。,线粒体内膜氧化损伤促使细胞原血红素释放,原血红素在动物体内主要存在铁卟啉（血红素）和铜卟啉（血蓝素），在植物体内主要存在钴卟啉（维生素B12）和镁卟啉（叶绿素），它们都是细胞载氧进行呼吸作用和植物细胞进行光和作用过程中的关键物质。,卟啉类,血红素（铁卟啉）,三价铁离子,二价铁离子,高铁血红素,亚铁血红素,原卟啉IX,原血红素（亚铁原卟啉）,原卟啉15个异构体,原血红素a/b/c/等,氯化高铁血红素羟基高铁血红素等,卟吩,血红素家族,二亚硝基亚铁血红素碳氧亚铁血红素等,胚期原血红素胎儿期原血红素成人型原血红素,血红素a卟啉环的第八位上以甲酰基代替甲基，第二位上以羟代法呢烯基代替乙烯基。,血红素b（甲酰血红素）卟啉环上的侧链取代基为4个甲基,蛋白质分子,半胱氨酸,血红素c卟啉环上的乙烯基与蛋白质分子中的半胱氨酸巯基相加成的硫醚键共价结合,细胞色素A,细胞色素B、细胞色素P450、血红蛋白和肌红蛋白等,细胞色素C的活性基,血红素a/b/c共同或分别存在于铁硫蛋白及辅酶Q、ATP合酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、单胺氧化酶、血红素加氧酶、NAD（P）H氧化酶、鸟氨酸氧化酶、一氧化氮合成酶、腺苷酸激酶、苹果酸还原酶等120余种酶类中。,线粒体（mitochondria）在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。线粒体消耗着人体95%以上的氧，并以ATP的形式生产人体几乎所有的能量，素有“细胞动力工厂”之称。整个人体里约有1亿亿个。线粒体是重要细胞器；原血红素是线粒体功能关键物质；原血红素a/b/c在线粒体中存在最多,也是原血红素a/b/c最集中的细胞器。,线粒体是原血红素最集中的细胞器。原血红素a/b/c在细胞线粒体内，以细胞色素和以原血红素为活性基的酶两种形式参与氧化磷酸化反应电子传递。原血红素与珠蛋白结合在一起发挥作用，称为血红素蛋白。使用新型X射线激光衍射测定血红素蛋白结构表明，原血红素就位居线粒体基膜处血红素蛋白多肽构成的疏水桶（血红素口袋）内。,原血红素位于血红素蛋白折叠形成的疏水核（血红素口袋）内，它主要依靠Fe2+与F8His的咪唑氮配位而挂在Pr链上。在链中，有一个丙酸基与CD3His相连；在链中，原血红素的两个丙酸基别CD3Ser和E10Lys相连。,线粒体的的强氧化损伤，使血红素蛋白中珠蛋白与原血红素之间的亚基之间作用力减弱，离子键、氢键、疏水键断裂，使多肽链的折叠伸展、断裂。血红素口袋被打开，使那些原来包藏在蛋白疏水核部的原血红素释放谓之肿瘤细胞原血红素（ProtohemeofTumorCellsTCPH）。,再者，超氧自由基是一种亲脂性小分子，可以进入疏水核内，它所带的负电荷中和了肽链上His、Lys所带的正电荷，使它们不再与原血红素丙酸基侧链保持静电吸引，从而使原血红素脱落。,肿瘤细胞崩解,肽链与血红素之间结合力消失,血红素口袋被打开,糖酵解,瓦伯格氏效应,肿瘤抑制基因失活,原癌基因的激活,羟自由基氧化损伤,超氧自由基负电荷作用,程序性铁死亡,芬顿氏反应,低氧微环境,糖酵解调节机制异常,线粒体氧化磷酸化功能损害,原血红素释放,利用荧光染料DCFH-DA（2,7-二氯荧光黄双乙酸盐）进行活性氧检测。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。此实验证明肿瘤细胞活性氧明显增高。,中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所戴宇飞教授等用正丁醇抽取原血红素辅基，再进行Sephadex-100柱层析，柱的规格57X1.8cm，用0.9%Nacl溶液洗脱，280紫外检测铁离子，对活性氧损伤血红素结合蛋白导致原血红素的释放，提供了试验依据。,原血红素a/b/c,供氧体,氧化物,供氢体,苯胺蓝,还原型,氧化型,【O】,【O】,染色,还原型,脱氢,H2O,肿瘤组织呈现组织高压状态。一是肿瘤组织中缺乏功能性淋巴系统。二是肿瘤血管具有高渗的特性。血液浓缩，间质内液体增多，血细胞外渗粘性阻力增大，最终出现肿瘤间质高压。肿瘤间质高压促进肿瘤炎症性渗出。,肿瘤性炎症最具特征性的变化是以血管反应为中心的肿瘤性渗出病变，肿瘤组织血管内的液体和肿瘤细胞成分通过血管壁进入组织间质、体腔、粘膜表面和体表的过程称为肿瘤性渗出。所渗出的液体和细胞总称为肿瘤性渗出液，其内含有较高的蛋白质和较多的细胞成分以及他们的崩解产物。,“种子和土壤”，强调癌细胞和微环境之间的关系，认为肿瘤转移的形成，是处于旺盛生长状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到合适的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会发生肿瘤的转移。“解剖机械”，认为CTC的转移为随机现象，CTC在最先到达脏器的毛细血管或淋巴结发生机械性滞留。,分泌液、渗出液、漏出液和黏液总称为“组织渗液”,组织细胞与微环境,组织液细胞与微循环之间的通路；几乎含有血液、淋巴液所有的非细胞内容物；细胞内环境，检测细胞变化的第一生物学介质；渗出至体外（粘膜、皮肤表面）称为组织渗液。,基因突变,Warburg效应,Ferton氏反应,血红素蛋白的血红素口袋,供氢体,肿瘤性组织渗液,羟自由基,苯胺蓝,原血红素a/b/c释放,强氧化损伤,肿瘤间质高压,肿瘤性炎症,肿瘤细胞原血红素a/b/c,供氧体,酶样作用,染色,分类原理方法技术属性创伤性操作费用用途瓦伯格影像学有创复杂昂贵诊断效应代谢成像瓦伯格病理学无创便捷经济筛查效应代谢染色,产品结构设备：全自动分析仪POCT试剂盒试剂：试剂A试剂B样本保存液全自动分析仪专用清洗液,全自动分析仪,【操作方法】1、全面的检查需要良好的照明，压舌板，手套和纱布垫。口镜或咽喉镜有助于口腔检查。依次检查牙、牙龈、口腔黏膜、舌、唾液腺导管口及软硬腭。应注意其形态、颜色、质地的变化，包括有无肿胀、增生、萎缩、点彩消失等；上皮覆盖是否完整，有无疱疹、丘疹、糜烂、溃疡、过度角化、瘢痕、肿块及色素沉着；是否有出血；挤压腮腺或下颌下腺时导管口处有无涎液流出及涎液的情况。若发现异常，用采样拭子在局部擦拭，取得口腔黏膜渗液和分泌液。一般取液量为0.51ml，以棉拭子头部全部湿润为度。2、取得口腔黏膜渗液和分泌液后，打开样本管（红塞），把拭子头部置入样本液内充分搅动，使蘸在上面的液体与样本保存液混匀制得样本液。,4、检测方法（1）自动化肿瘤细胞原血红素分析仪检测：把编号后的样本管置至分析仪样本位，启动设备。按设定程序自动将染色液A100L、样本液200L、染色液B100L依次加入至反应杯中，在540秒的时间节点测定肿瘤细胞原血红素的吸光度，通过分析设备自动评估口腔癌风险。（2）POCT分析法：向样本管内依次加入试剂A（黄塞）、试剂B（绿塞）各0.5ml，盖好样本管塞，颠倒样本管23次，使样本液与试剂混匀。静置。在5分钟时间节点观察反应液显色情况，并与比色板比对。,【检验结果的解释】不变色：阴性，尚未发现细胞发生异型性变化；淡蓝色：可疑阳性，细胞可能发生异型性变化；蓝色：阳性，细胞发生异型性变化；深蓝色：强阳性，细胞发生异型性变化。若反应液缓慢出现粉色或黄色，表明样本内混有较多粘液，仍存有显示蓝色的可能性，应再延长观察时间35分钟。若反应液即刻显深蓝色后转为深黄色或棕红色，表明标本内内混有血液，亦应视为强阳性