革兰氏染色法的过程及原理

革兰氏染色法的过程与原理一、过程1 .涂膜将培养的不同菌分别涂膜(注意不要把涂膜切得太厚)、干燥、固定。 固定时一次通过火焰l两次即可，不要过热。 最好不要用幻灯片烫伤手。2 .染色(1)初染草酸铰链结晶紫一滴，水洗约1分钟。(2)媒体滴加碘液流出残水，流出约1分钟的水。(3)脱色清洁载玻片上的水，使背景变白，用95 %酒精滴到流出的酒精不变成紫色的地方，约2030秒，立刻用水冲洗酒精。(4)用复染用番茄液染色1、2分钟，水洗。(5)镜检干燥后，安装油镜观察。 革兰阴性菌呈红色，革兰阳性菌呈紫色。 以分散细菌的革兰氏染色反应为标准，过密细菌常呈假阳性。(6)用同样的方法在载玻片上混合大肠杆菌和枯草芽孢杆菌制备，并与革兰氏染色进行了比较。二、原理革兰氏染色法(Gram stain )不仅将细菌的形态分类，还将染色反应为蓝紫色的革兰氏阳性细菌、g染色反应为红色(复染色)的革兰氏阴性细菌、g1染色的细菌全部分类。 细菌对革兰氏染色的反应是细胞壁的成分和结构不同的原因。 革兰阳性细菌的细胞壁主要由皮肤多糖形成的网状结构构成，在染色过程中用乙醇处理，由于脱水，网状结构中的孔径变小，透过性降低，结晶紫一碘复合体保持在细胞内难以脱色，因此在呈蓝紫色的革兰阴性细菌的细胞壁中，皮肤多糖的含量低， 脂质物质含量高，经乙醇处理后脂质物质溶解，细胞壁渗透性增加，结晶紫一碘复合体易被乙醇萃取脱色，然后被再染色液(番茄)染色，因此呈红色。革兰染色的关键是严格把握酒精脱色程度，脱色过度，阳性菌可感染阴性菌：脱色不充分，阴性菌可感染阳性菌。 另外，菌龄也影响染色结果，例如，阳性菌的培养时间过长，或者死亡菌和一部分菌自溶时，常常呈阴性反应。青霉素作用机制阻碍细菌细胞壁的合成。 青霉素的你的结果与细胞壁成分肽结构中的D-丙酰胺-D-丙氨酸类似，与后者竞争肽酶，阻碍肽的形成，引起细胞壁的缺损，细菌失去细胞壁的渗透屏障，使细菌灭绝。溶菌酶和青霉素对细菌细胞壁的作用溶菌酶的作用机制：水解病原菌的胶粘剂多糖碱性酶在细胞壁中的N-乙酰基瓜氨酸和N-乙酰基氨基葡萄糖之间的b-1， 破坏4 -糖苷键，将细胞壁不溶性多糖分解为可溶性糖苷肽，通过细胞壁破裂的内容进行物流使细菌溶解，溶菌酶就能与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅助蛋白形成复盐，使病毒失活，因此该酶具有抗菌作用判断细菌有无鞭毛的方法电镜观察、鞭毛染色、半固体穿刺培养、菌落形态观察描述细菌和古细菌在细胞膜上的主要化学差异革兰氏阴性菌的表层有由肽葡聚糖形成的细胞壁，壁外有由蛋白质、磷脂、脂多糖形成的膜层，与其中的细胞质膜相对应，特别称为细菌外膜。 外膜低于细胞质膜磷脂含量，但脂多糖含量高。 外膜的蛋白质与细胞质膜不同，主要部分由几种蛋白质组成。 其主要蛋白质部分与特异内表面的肽葡聚糖通过共价键结合。 脂多糖存在于外膜的最外层。 外膜上只知道磷脂酶，细胞与外界的联系中存在各种噬菌体、维生素B12、大肠杆菌素等受体，其中一些蛋白质与DNA的复制、细胞分裂有关，另外，外膜容易透过水溶性低分子物质，但抗菌物质是透过的障碍，是克对古细菌来说，细胞壁不含肽聚合物，有以蛋白质为主的，也有含杂多糖的，类似肽聚合物，但不含细胞壁酸、d型氨基酸、二氨基庚二酸。缺乏细胞壁的原核生物，除了自然存在于自然界的缺少壁的细胞，如支原体外，还可以抑制实验室菌种的突变、人为的新细胞壁的合成，通过酶解现有的细胞壁，得到缺少壁的细胞。无壁细胞主要有l型细菌、原生质体、球状体、支原体4种。l型细菌；在形成的实验室和宿主体内自发性突变形成的遗传性稳定的细胞壁缺陷株特征细胞庞大，渗透敏感，可在培养基中形成油煎蛋菌落，无具有正常繁殖能力实践意义的细胞壁机械固定，细胞及其柔韧性呈多样性，成为“过滤型细菌”。原生质体，球状体用形成的溶菌酶打碎原来的细胞壁，用青霉素抑制新生细胞壁的合成，最后得到只被细胞膜包裹的真球状的渗透敏感细胞无特征完整的细胞壁，细胞呈球状，对渗透压极为敏感，革兰染色阴性，细胞不能分裂，对相应的噬菌体不敏感，无繁殖能力实践意义比具有正常细胞壁的细菌更容易引入外源遗传物质，是研究遗传规律，进行原生质体融合育种的好材料支原体；在形成的长期演化中形成，适应自然生活条件