离心技术与细胞器分离PPT课件

。离心技术与细胞器分离。一个实验目的。1.以叶绿体和细胞核的分离为例，掌握离心机的操作技术和两种不同的离心方法：差速离心法和密度梯度离心法。2.光学显微镜被用来鉴别各种细胞器的提取和了解叶绿体和细胞核的形态。实验原理离心分离技术是根据颗粒在匀速圆周运动时受到向外的力的原理开发的一种分离技术。离心力(Fc)相对离心力(RCF)，离心力(Fc)，离心力是当粒子以一定的角速度在圆周上运动时的向外的力。离心力的大小(Fc)取决于角速度和旋转半径，即Fc=m2r，其中是以弧度/秒为单位的旋转角速度。r是粒子距旋转中心的距离，单位为厘米。m是以g为单位的质量，相对离心力(RCF)，也称为相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数。文献中常用“相对离心力”或“G数”。RCF=(m2r)/(mg)=1.11910-5n2r，其中r是离心转子的径向距离，指离心管重心和旋转轴中心之间的距离，单位为cm；g是地球的重力加速度(980厘米/秒2)；n是转子每分钟的转数。0.6-100，000 rpm以上的台式高速和超高速离心机概述、离心机的基本分类、离心机的结构以及离心机的主要部件是旋转头、主轴、电机和传动装置、制动器、外壳和框架。离心机头的主要类型有：角头式离心机、甩出转子/甩出转子以及离心技术的类型。常用的离心技术一般包括：差速离心、密度梯度离心。差速离心(differential diffusion)，采用逐渐增加离心速度或低速与高速交替离心，使不同颗粒在不同分离速度和不同离心时间下的沉降系数分批分离的方法，称为差速离心。它通常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。图8-9分子生物学约夫特谢尔(加兰科学2008)，高级超速离心机。原理：当不同的颗粒具有不同的浮力密度时，在离心力场的作用下，在密度梯度介质中，颗粒要么沉降下来，要么上浮，直到它们移动到与各自密度完全相等的位置，在那里颗粒没有重量，无论它们被离心分离多长时间，它们都不会再移动，形成一系列的密度区域。以便分离具有不同浮力密度的物质。氯化铯、氯化钌、蔗糖和甘油通常用作等密度梯度离心的介质。这种方法通常适用于尺寸相似但密度差异大的材料。它通常用于分离和提取核酸、亚细胞器和质粒。材料用蒸馏水洗涤。用滤纸吸水后，去脉，称取2克叶子，用剪刀剪开，放入研钵中。2.测量10毫升匀浆缓冲液，将5毫升倒入研钵中，开始研磨。3.用四层纱布过滤，将滤液收集到10毫升离心管中，然后用剩余的5毫升匀浆缓冲液冲洗灰浆，并过滤到管中，以5000转/分钟的速度离心5分钟，并除去上清液。4.加入0.5% TritonX-1002.5毫升，混匀，摇匀后静置3分钟，以5000转/分钟离心5分钟，除去上清液。5.加入1毫升缓冲液，混合均匀。沉淀物可以通过用枪头轻轻吹来溶解。上述步骤中提到的细胞核是不纯的，它与原生质、线粒体和叶绿体混合在一起。细胞核和叶绿体通过蔗糖密度梯度离心分离。7.向离心管底部加入3毫升含2.3M蔗糖的氯化铯缓冲剂3毫升。8.将3 Ml的60%过氧化氢溶液轻轻放在7。当用移液枪添加时，一定要小心地将一种溶液沿着管壁放在另一种溶液的上面。此时，应观察到明显的溶液分层。9.然后将6的过滤溶液轻轻放在8的溶液上。观察分层。10.3200g离心32分钟，溶液梯度层重新分布。11.分别吸收每层的部分溶液，用于改良品红酚染色和显微镜检查。观察不同大小和密度细胞器的分布及其形态特征。试剂，匀浆缓冲液：5 mm MES，6.8 mm氯化钙，11 mm KH2PO4，0.3 m山梨醇，0.3M甘露醇，0.4% PVP-30 . csk buffer :100mm KCl，3 mm GCL2，1 mm GTA (pH 8.0)，10 mm管道(pH 6.8)。300 MsUCRose . 60% PerCollcSkbuffer:60% PerColl，100mMKCl，3mMMgCl2，1 MgTa(PH8.0)，10 Mpipes(PH6.8)，300 M