下一代测序技术简介

. NextGenerationSequencing(NGS )技术综述、Sanger测序、Sanger测序法仍是基因测序行业内的金标准，但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈。 (价格高、步骤复杂、效率低)、NGS=NextGenerationSequencing、NGS为高吞吐量测量序列High-throughputSequencing(HTS )、第一次测序： sanger测序(Sanger sequencing ) 也称为第二代测序： ngs=massivelyparallelsequenceing (大规模并行测序)、第三代测序： NGS=HTS、singleoleculsequenting (高吞吐量、单分子测序)、 三大测序平台的技术特点与差异、Roche454测序原理、Roche454焦磷酸测序原理、Roche454测序过程、样本处理主要涉及大片段DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC平台利用超声波和氮气阻断将这些DNA分子碎片化，通过琼脂糖凝胶电泳回收或珠粒精制，选择500-800bp的DNA碎片。 对于未编码的RNA和PCR产物，不需要这个工序。 一、取样处理、Roche454测序工序、二、文库调制、文库调制分为接头连接和珠粒精制两个阶段、454个文库接头部分a、b两种，各44bp由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp(TCAG )的“key”碱构成、Roche454测序工序，三、连接微珠，将丰富的文库和测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，用振荡器激烈振动，使反应体系成为油包水(water-in-oil )的稳定乳浊液。 在理想的条件下，单独的液滴或微反应器只包含一个珠子和一条单链DNA，通过控制条件，可以在1mL的乳液中形成至少10的6次方的理想微反应器。 此外，在Roche454测序过程、四个emRCR、PCR放大之后，为每个磁珠形成一个密集的DNA集群，这些DNA序列完全相同并且可用于随后的过程。乳液PCR(emRCR )、Roche454测序工序、五、反应板的准备、机载测序、454测序的反应板被称为PTP(PicoTiterPlate )，包括由350万根光纤构成的小孔，各孔的直径为29 . Roche454测序程序，6，测序和分析，磁珠和测序试剂加入PTP，可用于升级机测序。在454测序仪中，a、t、g、c这4种碱分别贮存在不同的试剂瓶中，每次反应都有4种碱依次放入反应池中，碱结合后释放出焦磷酸(PPi )，该焦磷酸在酶的作用下将荧光体氧化为氧化荧光体，发出光信号、Illumina测序原理、Illumina合成测序原理、Illumina测序过程、桥式PCR、合成测序、数据读取、ABISOLiD测序原理、ABISOLiD测序过程微珠浓缩连接酶测序：SOLiD连接反应的基质为8碱基单链荧光探针混合物。 在连接反应中，这些探针依据碱补充规律与单链DNA模板链配对。 这样经过5次序列决定反应，得到所有碱基序列SOLID的二维码矩阵，ABISOLiD的连接序列决定原理、探针的5 末端标记有1色荧光色素。 探针3 端的15位是随机碱基，其中1、2位组成的碱基对表示探针染料的类型，35位的“n”是随机碱基，68位的“z”是与任意碱基配对的特殊碱基。 SOLiD测序反应的1次测序反应连接第15个碱基，同时切除第68个碱基，同时记录第12个碱基决定的荧光色。 ABISOLiD连接序列决定原理、ABISOLiD连接序列决定原理、两个碱基决定一种颜色，可大大提高序列决定的精度。、ABISOLiD连接排列决定原理、奥运排列决定反应后，以0、1位、1、2位的顺序连接与模板排列对应的颜色信息时，得到由“0、1、2、3”构成的SOLiD原始颜色排列。 454平台的优势是读取长度。 目前454系统的串行读取长度超过400bp。 454平台的测序成本远高于其他平台，但是对于从一开始就连接或环境微生物组学等需要长读长度的应用还是理想的选择。 同时总结了每个汇聚平台的特征，Roche454，Illumina，1 .可扩展的超高吞吐量GenomeAnalyzer系统现在可以在每次运行后获得超过20g字节的高质量滤波数据。 优化后，助熔剂有望上升到95GB，相当于人类基因组的30倍复盖度。 2 .所需样本量少的通用分析器系统所需样本量仅为100ng，可用于许多样本的有限实验(如免疫沉淀、显微切割等)。 3 .简单、快速、自动GenomeAnalyzer系统提供了最简单、最简单的工作流程。 原型库只需几小时即可完成，一周内可获得高精度的数据。 自动化过程不需要机器人操作或无尘室，而不会减少手工误差或污染的可能性。1.无与伦比的通量现在可以由SOLiD3系统一次生成50GB的人类基因组序列数据，相当于基因组的17倍垄断度，这显然是其他下一代测序系统无法实现的2 .正确性。 新的超精密检测模块(ECC模块)提供高达99.99%的精度，高达98%的可定位碱基质量值添加了标签，以提高灵敏度和动态范围高于45。高精度的原始读取顺序支持无参考序列的数据分析。 总结各测序平台的特点，ABISOLiD、第三代测序平台的比较差异，以及太平洋生物科学公司(PAC bios )实时单分子测序方案的形象。 a .单个零点启动模式波导纳米结构的侧视图，各纳米结构包含DNA聚合酶分子，固定在底部玻璃面上。 波导纳米结构和共焦成像系统保证仅对底部进行荧光检测。 b .显示了荧光标记的核苷酸基质混入序列决定模板的过程。 对应的瞬时荧光检测器被分成5个步骤。 太平洋生物科学公司，LifeTechnology公司，IonTorrent半导体测序技术图。 a .该芯片结构设计的分层显示图。 上层是单一的DNA聚合反应的微单元，底部的两层构成场效应晶体管离子传感器。 每个微单元都有各自的场效应晶体管探针，以识别各自的pH值的变化。 b .侧视图：在微池中，DNA聚合酶将2个TTP核苷酸混入测序片段中。 反应中释放的氢离子由以下场效应晶体管检测。CompleteGenomics公司、CompleteGe