课题3　血红蛋白的提取和分离 (8).ppt

思考1高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,思考2为什么人们用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,血液有哪些成分？,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝胶色谱法电泳法缓冲溶液它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：样品的预处理色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,（一）凝胶色谱法凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。又称分子筛层析。凝胶实际上是一些微小的多孔球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成，如葡聚糖、琼脂糖），具多孔的凝胶就叫分子筛。,一、基本概念及原理,原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长移动速度较慢,路程较短移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,（二）缓冲溶液,1、概念：,在一定范围内，能够抵制对溶液PH值的影响，维持PH不变。,2、作用:,外界的酸和碱,基本,通常由溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得在使用的缓冲液。,12种缓冲剂,使用比例,不同pH范围内,3、配制:,提问：在本课题中使用的缓冲液是:_。其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性).,磷酸缓冲液,思考：说出人体血液中缓冲对,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,2、原理：,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。,（三）电泳,1、概念：,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。,3、类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。,（1）琼脂糖凝胶电泳,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,琼脂糖凝胶电泳示意图,电泳检测PCR结果,（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。,分子的大小,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,SDS（十二烷基硫酸钠）是阴离子去污剂。作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，使电泳迁移率完全取决于。,考马斯亮蓝染色,银染,marker,marker,琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。,【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶色谱法的原理；(2)电泳法的原理。,A,二、实验操作,样品处理,粗分离：,纯化：,纯度鉴定：,透析去除样品中分子量较小的杂质,用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）,1.样品的处理（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的：。B、分离时采用离心，用洗涤，重复洗涤，直至。C、能否用蒸馏水代替生理盐水？,去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化,低速短时间（500r/min，2min）,五倍体积的生理盐水,三次,上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净,不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。,（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,（2）释放血红蛋白,思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？（使用磁力搅拌器充分搅拌）,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,（蒸馏水、甲苯）,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,（3）分离血红蛋白溶液,将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层。,甲苯层（无色透明）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层（暗红色）,柜式离心机,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质）,（1）用方法进行粗分离，透析袋由半透膜制成，常用。将透析袋放入溶液中进行透析。（2）透析的原理是，。（3）透析的目的是。,透析,玻璃纸、肠衣、膀胱膜,透析袋能使小分子自由进出而将大分子保留在袋内,去除样品中分子量较小的杂质,磷酸缓冲,取()ml的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时。,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,1,（4）透析操作,透析过程动画演示,（1）凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。,3.纯化（凝胶色谱）-去除相对分子量较大的杂质蛋白,凝胶色谱柱的制作,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：材料交联葡聚糖凝胶（G-75）。凝胶的前处理配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,蒸馏水或洗脱液,“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。,凝胶色谱柱的装填方法：A.固定：将色谱柱装置固定在支架上。B.装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。C.洗涤平衡:装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分12小时。,洗涤平衡,注意：1.液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。,50cm,注意：1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？,如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。,思考,装配好的凝胶柱,(3）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口。,缓冲液,凝胶面,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,加透析样品,调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：加到色谱柱的（）样品渗入凝胶床：（）再调整缓冲液面洗脱：收集：待（）接近色谱柱底端时收集。,顶端,样品完全进凝胶层,红色的蛋白质,色谱柱制作成功的标志：红色区带均匀一致的移动,记,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。,在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,思考,与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。,样品的粗分离,纯化,纯度鉴定,思考,你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,4、纯度鉴定（电泳）SDSPAGE1、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）,拔出梳子将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）在电泳槽中加入缓冲液点样。,点样,电泳,结果,【典例2】(2011扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：,(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。(3)甲装置用于_，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。,运输,磷酸缓冲液,洗脱血红蛋白,透析(粗分离),去除样品中相对分子质量较小的杂质,凝胶色谱法,相对分子质量的大小,红色的蛋白质接近色谱柱底端,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,教学反馈,1凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白,B,B,B,A,5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。A.NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的