结核病分子生物学及分子流行病学PPT课件

.,1,结核病实验室诊断及新诊断工具,安徽省结核病防治研究所安徽省胸科医院王庆,.,2,一.结核病细菌学基础二.结核病实验室诊断方法三.结核病实验室新诊断工具,.,3,一.结核病细菌学基础结核分枝杆菌,.,4,分枝杆菌1882年KOCH发现，至今已经发现100多种，有结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌、麻风杆菌。引起肺结核的主要有人型、牛型、非洲、田鼠等结核分枝杆菌，称结核分枝杆菌复合群；(结核分枝杆菌是缓慢生长菌）大部分非结核分枝杆菌不致病,部分非结核分枝杆菌可引起人体类似结核样病变非结核分枝杆菌肺病；麻风分枝杆菌引起麻风病。,.,5,分枝杆菌分类,分类生长速度菌落和色素产生代表菌种致病性结核分枝杆菌复合群生长缓慢结核分枝杆菌、结核病牛分枝杆菌非结核分枝杆菌Runyon组生长缓慢菌落不见光时为淡黄色,堪萨斯分枝杆菌肺结核样病变光照后则变为黄色或橙色海分枝杆菌结节与溃疡Runyon组在37生长缓慢在暗处培养时菌落瘰疠分枝杆菌儿童淋巴结炎呈橘红色Runyon组4042下生长慢通常不产生色素鸟-胞内分枝杆菌结核样病变，多见于肺与肾Runyon组在2545快速生长。培养57天即可见到菌落个别种产生色素偶发分枝杆菌极少致病麻风分枝杆菌人工培养基上不生长麻风病,.,6,结核分枝杆菌,是一类细长略弯曲的长杆菌，由于细胞壁含有大量脂质，能抵抗酸酒精脱色能力，抗酸染色阳性。缓慢生长菌。致病性与菌体成分有关，荚膜-多糖；脂质-索状因子、磷脂、蜡质D；蛋白质。易发生形态、耐药、毒力、免疫性变异。对干燥抵抗力强，对湿热、紫外线敏感。,.,7,病灶中结核分枝杆菌菌群：结核病变中有四种不同代谢状态的结核菌群,它们对化学药物的反应各不相同：A群：快速生长菌，生长繁殖旺盛，致病力和传染性强，存在于细胞外，多在疾病早期的活动性病灶和空洞内，容易被抗结核药物所杀灭，异烟肼效果最好，起主要杀菌作用，链霉素及利福平亦有效。B群：缓慢繁殖菌，存在于干酪坏死灶内，结核杆菌常呈休眠状态，偶尔发生短暂的生长繁殖，仅对少数药物如利福平敏感。C群：间断繁殖菌，存在于巨噬细胞内，细菌得到酸性细胞质的保护，但繁殖缓慢。吡嗪酰胺在pH5.5时，杀菌效果较好。B群与C群为顽固菌，可存活数月、数年，亦称“持续存活菌”，是日后复发的根源。D群：完全休眠菌，病灶内有少量结核杆菌完全处于休眠状态，无致病力及传染性，药物对其无作用。,.,8,结核病化疗,抗结核药物的治疗目的是快速杀灭病灶内的大量快速生长A群菌，以及缓慢和间歇繁殖的B、C菌群，已达到治愈。结核病化疗应该是高效杀菌，低不良反应。INH对A群结核杆菌有抑制和杀灭作用；A、B、C菌群对RFP高度敏感，均有杀菌作用，是治疗结核病标志性药物；SM对细胞外结核杆菌（A）有杀菌或抑制作用；PZA仅对细胞内（C)有杀菌作用；EMB对细胞内外有相仿的抑制作用。,.,9,体积相同性质不同病灶与含菌量肺结核的传染性决定病人痰中结核菌的数量和病人的咳嗽症状。涂阳病人排菌量大，是主要传染源，涂阴培阳病人传染性小。,直径2cm的空洞含菌数108-9直径2cm的干酪病灶菌量约105-6直径2cm的结节病灶或闭合干酪灶102-3,.,10,化疗前后结核杆菌的定量分析,对痰菌阳性病人在化疗前后做结核杆菌培养的定量分析化疗前每ml细菌数106(1000000/ml-4+）化疗2周后减少至5（50000/ml-2+）4周减少至0.25(2500/ml-阴性）,化疗后结核杆菌呈对数减少以至消失，降低了传染性,.,11,二.结核病实验室诊断方法细菌学检查涂片、培养、药敏免疫学检查皮试、结核抗体,.,12,痰涂片检查的意义1、发现传染性肺结核的主要方法目前，控制结核病流行以发现和控制传染源为主。我国优先控制痰涂片阳性肺结核。2、评价传染性肺结核的化疗效果抗结核药物的化疗机理是杀灭病灶中结核杆菌，评价结核病的化疗效果，必须以抗酸杆菌检查结果作为依据。3、为结核病疫情的流行病学统计服务传染性结核病在流行病学中有特殊的意义，在反映一个国家或地区结核病疫情的严重程度的指标中，涂阳患病率等被更多关注。,.,13,痰标本的含菌量与痰涂片阳性检出率的关系,初诊的肺结核可疑症状者要进行3次痰涂片检查，强化期末和疗程结束前均应查2次痰涂片。查痰宣教，告知病人。,.,14,涂片检查法,优点：适用于痰、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值；是发现和确定传染源的主要方法，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；操作简便、快速，成本低廉，适于各级实验室开展；约10-20肺结核病人痰涂片阳性。缺点：敏感性低：每毫升含5000-10000条以上抗酸菌才可得到阳性结果；特异性较低：只能报告“抗酸杆菌阳性”，不能区分结核和非结核分支杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。,.,15,TB可疑者TB病人,标本收集及保存,标本接收和登记,涂片,染色,显微镜检,结果记录,材料准备,涂片保存用于EQA,标本/污染物的安全丢弃,结果报告,痰涂片显微镜检查流程,.,16,查痰对象,结核病可疑者咳嗽、咳痰超过2周咳血或伴有血痰发热或胸痛超过2周胸部X线异常少量查痰代胸片的受检者,.,17,痰标本收集,容器：广口、螺旋盖、可密闭、不易泄漏标本性状：干酪痰、血痰、粘液痰、唾液采集时间：即时痰、晨痰、夜间痰,.,18,痰标本采集宣教,指导病人：深吸气2-3次，每次用力呼出从肺部深处咳出将打开盖的痰盒靠近嘴边收集痰液拧紧盒盖可能需要反复尝试，才能留取一份理想的痰标本,.,19,只有高质量的痰液才能有准确可信的抗酸菌结果,.,20,涂片,编号涂抹痰标本自然干燥,.,21,载玻片：一张载玻片上只能涂抹一份痰标本。每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于抗酸杆菌涂片检查。应使用95%乙醇擦拭或浸泡脱脂，用干燥、清洁、无划痕的新载玻片涂片，在玻片背面左侧1/3处注明实验序号及标本序号（如载玻片有磨砂面，可用2B铅笔书写编号。如载玻片没有磨砂面，必须用玻璃笔(或腊笔)书写编号。,.,22,显微镜检查,1.接通电源，打开开关上升聚光镜至最高，调节光圈7080大小2.将涂片放在载物台上，痰膜朝上在油镜下，至少检查300个有用的和有代表性的视野（至少5分钟）,.,23,8、结果报告,.,24,结果按规定记录在结核病细菌学实验室登记本和化验单上，报告痰涂片结果应注明痰标本的性状。阴性结果应观察300视野，观察时间不少于5分钟。阴性结果应填写“阴性”，不得以“”表达。,.,25,分支杆菌分离培养意义1、在结核病诊断上具有重要意义，是目前结核病诊断的“黄金标准”;2、提高阳性率,使少数细菌也能长出来;3、进一步进行药敏试验、菌型鉴定、DNA分析等。培养的主要方法有：1、传统的改良罗氏培养基，需4-8W才能报告结果；2、快速液体培养，5-7天报告结果，可做药敏。什么情况下要做培养：1.涂阴要做鉴别诊断时，培养阳性可确诊为肺结核；2.抗结核治疗失败，要做培养进行菌型鉴定和药敏试验。,.,26,常规培养（罗氏培养基）,优点：灵敏度高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验缺点：需时长久，48周；阳性率偏低，约30-40%；无法鉴定结核与非结核分支杆菌。被誉为诊断结核病的“黄金标准”,.,27,培养操作方法,标本前处理目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力原则：尽可能杀灭标本中的杂菌，尽可能保存标本中的分枝杆菌步骤：取12ml痰标本至前处理管视标本性状加入12倍体积的4氢氧化钠震荡3060秒至标本完全液化室温静置15分钟（整个处理时间不得超过20分钟）,.,28,培养操作方法,接种用无菌吸管取前处理后的标本接种0.1ml至酸性罗氏培养基斜面尽量使菌液均匀铺满斜面每份标本接种2支培养基,.,29,结果的观察与报告接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况此后每周观察一次，直至满8周，每次观察记录菌落生长及污染情况分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长分枝杆菌培养阳性（1+）：菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）：菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）：菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）：菌落生长布满整个斜面菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。,培养操作方法,.,30,结核分枝杆菌耐药性测定（常规）,我国是27个耐药结核病高负担国家之一，当前耐药结核病诊断主要依据DST，DST对有效化疗方案的建立和预后的预测具有重要意义。方法：结核杆菌耐药性测定的方法有绝对浓度法、比例法、仪器快速法和耐药基因检测法等。意义：指导用药：化疗前药敏选择用药;疗效不佳时药敏观察有无耐药性、调整用药。监测社会中耐药结核菌株的流行情况评价和改进国家结核病控制措施的重要参考因素之一。,.,31,耐药结核病相关定义,判断耐药结核病需要通过体外药敏试验证实结核杆菌是否耐药。单耐药：对一种一线抗结核药物耐药。多耐药：对一种以上的一线抗结核药物耐药。耐多药（MDRTB）：至少同时对INH和RFP耐药。严重耐多药（XDRTB）：至少同时对INH和RFP耐药外，还对任何氟喹诺酮类抗生素（如：氧氟沙星）产生耐药，以及三种二线抗结核注射药物（如：卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等）中的至少一种耐药。,.,32,耐药结核病疫情现状,来自于2007-2008年全国结核病耐药性基线调查：1.从涂阳肺结核病患者分离的结核分枝杆菌总耐药率为37.79%，其中初治肺结核总耐药率35.16%、复治肺结核总耐药率55.17%。2.从涂阳肺结核病患者分离的结核分枝杆菌总耐多药（MDR-TB）率为8.32%，其中初治肺结核总耐多药率5.71%，复治肺结核总耐多药率25.64%，3.总广泛耐药（XDR-TB）率为0.68%，其中初治患者为0.47%，复治患者为2.06%。,.,33,耐药结核病疫情现状,4.根据此次调查结果估算，我国每年新发耐多药肺结核患者约12万例，其中广泛耐药肺结核患者近1万例。5.耐多药肺结核患者分布以农村为主，青壮年患者比例较高，耐药结核病的性别分布没有统计学差异。6.不规范抗结核治疗及患者依从性差是耐药性产生的主要危险因素。,.,34,免疫学检查,1、细胞免疫学诊断-结核菌素试验是常用的诊断与辅助诊断方法，其原理为IV型超敏反应。临床意义:(1)为接种卡介苗提供依据；(2)为测定免疫效果提供依据；(3)用于诊断与鉴别诊断。2、体液免疫学诊断（血清学诊断）是检测结核抗体，细胞免疫随者病情的加重而减弱，体液免疫随着病变的加重（或血行播散）而增加，这种细胞免疫与体液免疫分离的现象在结核病方面表现非常明显。临床意义：活动性肺结核的诊断与鉴别诊断；各种肺外结核的诊断与鉴别诊断；器官移植并发结核感染的诊断。,.,35,三.结核病实验室新诊断工具（一）细菌学诊断技术（二）免疫学诊断技术（三）分子诊断技术,.,36,（一）细菌学诊断新技术,1、快速培养基液体培养基米氏7H9液体培养基双相培养基同时含有液体培养基变色培养基固体、液体培养基2、快速检测方法噬菌体法检测技术液体培养结合显微镜观察技术,.,37,1、快速培养基-液体培养基,米氏7H9液体培养基（肉汤基础）营养丰富：油酸、白蛋白、葡萄糖、过氧化氢酶等细菌可获得充足的养料：营养添加剂对于许多分枝杆菌生长至关重要抑制污染：添加PANTA抑菌剂（多粘菌素B、两性霉素B、萘啶酸、甲氧苄氨嘧啶、阿洛西林）,.,38,全自动分枝杆菌检测系统（液体培养基）BACTEMGIT960System全自动分枝杆菌检测系统BacT-ALERT3D全自动快速微生物/分枝杆菌培养侦测系统,.,39,先进灵敏的检测技术性能优异-高检出率、低检出时间安全可靠-工作人员得到最佳保护大容量：960个培养管/台，操作简单完善的培养、鉴定和药敏实验解决方案高性能价格比国际市场上唯一的专业分枝杆菌培养、鉴定和药敏实验系统,BACTECMGIT960System全自动分枝杆菌检测系统,.,40,BactecMGIT960的基本原理是其所使用的培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测系统每隔60分钟连续测定培养管内荧光强度，从而判断管内分枝杆菌生长情况。该培养仪可用于痰、支气管盥洗液、胸水、腹水、脑脊液、尿液、脓液、关节液、病灶组织或干酪块各种临床标本的分枝杆菌培养、初步菌种鉴定和药物敏感试验。结果表明：BactecMGIT960与BactecTB460、L-J三种方法的阳性率分别为80%、85%和71%，本平均报告时间为分别为13.3天、14.8天和25.7天。,.,41,3D-240型血液、结核分枝杆菌培养仪可同时进行血培养、无菌体液微生物培养及快速结核杆菌培养。,全自动快速微生物/分枝杆菌培养侦测系统,可同时处理血液、体液的待检标本,.,42,BacTALERT3D检测原理：产色检测技术,细菌生化代谢细菌生长产生CO2CO2降低pH值颜色感应器转为黄色培养瓶底的颜色感应器含有溶解染料的硅胶不可逆颜色改变黄色阳性培养,结果3D系统和常规培养法检测分支杆菌平均报告时间分别为11.7天和26.8天。,.,43,液体培养基,培养时间短（814天）阳性率高（比L-J增加1520%）可做药敏试验（仪器57天）,优点,缺点,不能观察菌落特征费用较贵,.,44,分枝杆菌快速培养和耐药性测定分枝杆菌快速耐药性测定主要有BACTEC460、BACTEC960、BacT/ALERT3D系统，标本的前处理方法和接种方法基本一致，但检测原理不同。,Bactec960测定系统BacTALERT3D测定系统,.,45,分枝杆菌快速耐药性测定,阳性培养管取出后直接涂片进行抗酸染色以确定是否为AFB。用阳性培养管制备菌悬液，接种于含有抗结核药物的培养管中，然后置培养仪中进行培养，根据分枝杆菌的生长情况而判断该药物敏感性。分枝杆菌快速培养检出时间平均10天；快速药敏检出时间平均5天药敏试验检测包括RFP、SM、EMB、INH、PZA，同时用户可进行自定义药敏试验,.,46,2.免疫学诊断新技术,(1)结核蛋白芯片(2)特异性T细胞检测酶联免疫斑点试验（T-SPOT）,.,47,(1)结核蛋白芯片,蛋白芯片始创于90年代初，又称DNA芯片。其原理是将结核杆菌多种特异性蛋白抗原（16KDa、38KDa、LAM）固定在固相载体上，然后与待测样本的抗体结合，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品中抗体分子的数量和序列信息。该方法同时将大量蛋白抗原固定于支持物上，所以一次可以检测多种抗体等信号。基因芯片技术也可应用于结核杆菌的基因分型与菌种鉴定、耐药性测定。,.,48,蛋白芯片法检测结核抗体,结核蛋白芯片可以检测结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗体，结核分枝杆菌蛋白16-KDa抗体和38-KDa抗体三种。临床意义（1）鉴别痰涂片阳性者是否属于结核杆菌感染。（2）提高痰涂片阴性患者的检出率。（3）肺外结核的检测。,.,49,结核蛋白芯片检测结核抗体的灵敏度38.5%，特异度96.5%。不同类型结核病阳性率：培养阳性结核病61.2%、培养阴性结核病45.7%、结脑29.9%、结核性胸膜炎23.3%、骨结核27.3%。结核蛋白芯片诊断结核病是较有效的方法之一，具有较好的特异性和快速诊断等优点。,.,50,(2)特异性T细胞检测酶联免疫斑点试验（T-SPOT）,原理：结核菌感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-），通过高灵敏度的酶免法使IFN-滞留在微孔板表面，显色底物在反应部位被酶分解成沉淀的色素斑点。每一个斑点代表一个干扰素分泌细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。又称干扰素释放试验。检测用的抗原：ESAT-6和CFP-10ESAT-6和CFP-10二种蛋白只存在于结核分枝杆菌中。,.,51,潜伏性结核的诊断和治疗大量的潜伏性结核感染者是新发结核病患者的主要来源，潜伏感染的人群数量非常庞大，因此，我们必须通过努力鉴别并治疗这些潜伏期的结核感染者。以前潜伏感染主要依赖于皮肤试验诊断，该试验特异性低，与BCG和其他分枝杆菌感染有交叉；灵敏度低，活动性结核病中灵敏度7590%，特别在播散性结核病和免疫功能低下更低。,.,52,临床意义及应用价值,阳性结果：说明患者体内存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。阴性结果：说明患者体内不含有针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。活动性结核病的诊断结核潜伏感染者的诊断HIV合并结核感染的检测区别结核感染者与BCG接种者,.,53,ELISPOT技术优点特异性好：只针对结核分枝杆菌，对绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗无交叉反应。灵敏度高：基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率，快速简便。ELISPOT技术缺点缺点是操作繁琐，需特殊仪器设备试剂费用昂贵,.,54,结核病实验室新诊断工具,世界卫生组织建议使用分子生物学方法来检测耐多药结核病,.,55,分枝杆菌复合群中的耐药基因,结核分枝杆菌复合群耐药基因,.,56,利福平：rpoB基因通常检测rpoB基因的常见突变位置(codingforthe-subunitoftheRNApolymerase)来判断利福平耐药性rpoB基因是编码结核分枝杆菌RNA聚合酶亚单位，9095%的利福平耐药由该基因突变引起，主要集中于509533的利福平耐药决定区，为高水平耐药。,.,57,利福平：rpoB基因,rpoB基因的常见突变位点及频率从高至低依次为：531位、526位、516位、513位、533位。GenoTypeMTBDRplus检测：耐药突变位点531、526A、526B、516,.,58,异烟肼：katG和inhA基因检测KatG基因(codingforthecatalaseperoxidase)及inhA基因(codingfortheNADHenoylACPreductase)来判断异烟肼耐药性；katG基因：编码触酶-过氧化物酶，40-100%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为高水平耐药。inhA基因：编码NADH（还原型辅酶）烯酰基ACP还原酶，25%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水平耐药。GenoTypeMTBDRplus检测：katG基因有2个耐药突变位点；inhA基因有4个耐药突变位点。,检测原理,.,59,三、耐多药结核病新诊断工具,（二）耐多药结核病新诊断工具分子生物学诊断技术1、基因芯片（Genechip）：诊断结核感染及对异烟肼和利福平的药物敏感性2、线性探针杂交（HainLPA）：诊断结核感染及对异烟肼和利福平的药物敏感性3、实时PCR技术（GeneXpert）：诊断结核感染及对异烟肼和利福平的药物敏感性4、DNA测序：诊断异烟肼和利福平的药物敏感性,59,.,60,1.基因芯片,激光共焦扫描仪,软件判读,样品制备仪,杂交仪,结核分枝杆菌耐药检测基因芯片是基于结核分枝杆菌rpoB/katG/inhA（利福平、异烟肼）的基因位点突变与耐药性相关，通过PCR扩增和核酸杂交，检测荧光信号的有无，判断特定位点突变情况的耐药性检测方法。,获国家医疗器械证书和欧盟CE认证,60,.,61,1.基因芯片基因芯片始创于90年代初，是近年来发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法。基因芯片测定耐药性的主要步骤为：1)制备测定耐药性的基因芯片；2)获得待测样品DNA并进行PCR扩增和标记；3)扩增产物与芯片探针进行杂交、显色；4)扫描检测、数据处理、结果判定。目前，基因芯片技术已在结核分枝杆菌的基因分型与菌种鉴定、耐药性测定及基因组比较分析研究中得以应用，其中尤以耐药性测定最为引人关注。,.,62,1.基因芯片,62,.,63,1.基因芯片,应用：耐多药结核病筛查，国内在4个省的4个地市级评估。,63,.,64,1.基因芯片,标本：涂阳痰标本、培养阳性菌株时间：约8小时注册：通过国内SFDA注册,64,.,65,2.线性探针耐多药结核病检测技术Hain-MTBDRplus,原理：是多重PCR，用4对引物包括16S鉴定、rpoB、katG和inhA基因进行PCR扩增，PCR扩增后的产物与预先固化在膜上的27条野生和突变特异性探针杂交，检测rpoB、katG和inhA基因突变位点,诊断利福平和异烟肼耐药性及分型。在核酸探针基础上发展起来的线性探针杂交技术（LiPA）已应用于耐药基因突变的检测。有报道RFP耐药菌的敏感性为94.4，与药敏结果的符合率为96.4。本法快速、简便，有一定的实用价值。缺点是价格太贵。,65,.,66,2.线性探针耐多药结核病检测技术,66,DNA提取用NALC/NaOH处理痰标本,2)PCR扩增,3)杂交扩增产物和固化在膜上的特异性探针杂交,4)结果判读,.,67,Hian检测步骤,涂阳样本（需先经消化处理）,培养物（来自固体/液体培养基）,探针杂交,DN