双萤光素酶报告基因技术

ReportSmartly萤光素酶报告基因技术,自然界的萤光,发光海星发光甲壳虫,发光真菌,发光节虫,自然界的萤光,发光鱼发光甲虫,自然界的萤光,萤火虫,报告基因的作用,细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或”效果”,荧光-Fluorescence萤光-Luminescence,Luminescencevs.Fluorescence,各种报告基因的优点和缺点,萤光素酶报告基因的主要优点,非放射性检测快（比CAT等）灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）线形范围广（在10-16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言)生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力,萤光素酶报告基因的使用,原理:制备含有luc/Rluc的DNA转染提供刺激测量萤光,调节序列,Luc,在活细胞中做报告基因检测,外界刺激(导引物),萤光素酶基因,蛋白质折叠,调节序列,加工,转录,转录因子,信号转导,翻译,反义RNA,受体,蛋白-蛋白相互作用,RNA酶,病毒感染和增殖,RNAi抑制,启动子/增强子分析,“碰撞启动子”:全序列:2)逐步缺失:,Promoter,luc+,Light,Promoter,luc+,Light,Promoter,luc+,FireflyandRenilla,萤火虫生物萤光的化学,萤光素,+ATP+O2,萤光素酶,Oxyluciferin+AMP,+PPi+CO2+Light,萤光素酶:单体,61,000Daltons,辅-底物:ATP.Mg2+,萤光素:,Mg2+,海肾萤光素酶反应,Coelenterazine,+O2,萤光素酶,Coelenteramide,+CO2+Light,萤光素酶:单体,36,000Daltons,萤光素:(Coelenterazine),Enzymestructures,Firefly,Renilla,为什么要使用双报告基因,报告基因A(首要信号),报告基因B(第二信号),特异生物学反馈+非特异生物学反馈,非特异生物学反馈,检测结果,比较首要与第二信号确定特异生物学反馈,细胞可能有内源脱乙酰基酶-Gal或GUS活性.CAT,-Gal和GUS检测是终点检测.不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏而快速,传统的双报告基因的缺点,双萤光素酶报告基因系统比用CAT和-Gal做内对照的优点,速度样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成灵敏两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低方便一管完成检测，样品不必分份,实验质粒,对照质粒,用海肾萤光素酶作对照归一实验变化,归一反应=,对照的（海肾萤光素酶),实验的(萤火虫萤光素酶),萤火虫萤光素酶,海肾萤光素酶,用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫+海肾）,数据处理举例,第一天萤光素酶活性(RLU)比率归一的活性样品处理重复（F:R)变化倍数对照5,1282,5117,5533,81510,5555,4137,7453,9131.981.00处理5,13764,46740,7123,57488,7877,6546,02925,23211.525.82处理B1587,6355,144988,3478,8323409,8813,564661,9545,847113.2157.18第二天对照15,52920,4330.7621,89730,8410.7110,76013,6200.7916,06221,6310.741.00处理850,23920,843578,95114,830943,87321,788791,02119,15441,3055,81处理D114,86519,3-058,96712,28413,76720,24612,53317,2780.730.99,活性倍数(F/R)样品=F/R)对照第二天处理计算如下：活性倍数(791,021/19,154)=（16,062/21,631)=55.81,GloMax20/20Singletubeluminometer,GloMax96luminometer,Whitemicroplatesforluminescence,Promega公司出品的双报告基因实验产品,质粒萤火虫萤光素酶质粒海肾萤光素酶质粒叩头虫萤光素酶质粒检测系统非均质双报告基因检测系统（通量较低）均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化）,载体-萤火虫萤光素酶载体,pGL3家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter,pGL3-BasicMap,pGL3-ControlMap,pGL3-EnhancerMap,pGL3-PromoterMap,辅助报告基因的相对萤光单位(RLU)启动子交叉交谈或互相干扰实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节,内对照载体可能存在的问题,载体-海肾萤光素酶报告基因载体,Renilla萤光素酶载体系列,内含子,T7启动子,CMV即时早期增强子/启动子,phRL-CMV,HSVTK启动子,phRL-TK,SV40晚poly(A),SV40早期增强子/启动子,phRL-SV40,MCS,phRL-null,hRL基因,TK启动子,phRL-TK(Int-),MCS,phRG-B,合成poly(A)信号转录停止位点,三个读码框的终止密码子,phRG-TK,合成poly(A)信号转录停止位点,三个读码框的终止密码子,TK启动子,hRL基因,SV40晚poly(A),Renilla萤光素酶载体系列,用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因,Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因系统（非均质检测）E1910，100次E1960，E1980，1000次Dual-GloTM萤光素酶检测系统（均质检测）E2920，10mlE2940，100mlEE2980，10X100ml,均质检测与非均质检测,发光,细胞+培养基,添加试剂,细胞+培养基,除去培养基,发光,清洗细胞,裂解细胞,添加试剂,均质检测,非均质检测,Dual-Luciferase报告基因检测系统组分,检测缓冲液II底物（冻干粉）Stop&Glo缓冲液Stop&Glo底物,50X被动裂解液,5X,Dual-Luciferase报告基因检测步骤,裂解细胞被动裂解除去培养基.PBS洗.加1XPLB,振荡15分钟.检测主动裂解除去培养基.PBS洗.在1XPLB中刮下细胞.细胞转移到试管或小瓶中.1-2次冻融.检测检测,双萤光素酶检测方案,1支试管2步检测30秒钟,LuciferaseAssayReagentII,Passivelysisbuffer,Stop&GloReagent,DLRTMForHTS,DLR双报告基因检测系统应用举例,黑色素刺激激素(-MSH)对由人酪氨酸酶启动子增强子控制的萤光素酶的表达的诱导(PromegaeNotes)目的：监测细胞对-MSH诱导的应答材料：实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子增强子Luc(+)阳性对照：pGL3-Control阴性对照：pGL3-Basic内对照：pRL-SV40B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323)DLR双萤光素酶检测试剂盒,步骤前一天：接种细胞，六孔板X3第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组）pGL3-Control和pRL-SV40pGL3-Basic和pRL-SV40裂解细胞，测量萤光,Dual-Glo萤光素酶检测系统,检测特点均质检测，为高通量检测而设计萤光信号稳定，2hrs内检测自发萤光低于检测水平,Dual-GloAssay:同一样品中检测两种萤光信号,Stableluminescencesignalsforbothreporters(t1/23.5hrs.)10,000-foldsignalseparationbetweenthefireflyandRenillabioluminescence,Primaryreporter:Fireflybioluminescence,Secondaryreporter:Renillabioluminescence,Cellsinculturemedium,Addfireflyassayreagent,Addcombinationfireflyquenchreagent&Renillaassayreagent,Dual-Gloassay-选择性淬灭萤火虫萤光,Selectivequenchoffireflyluminescence,Dual-Glo萤光素酶检测系统,试剂盒组成Dual-Glo萤光素酶缓冲液Dual-Glo萤光素酶底物（冻干粉）Dual-GloStop-Glo缓冲液Dual-GloStop-Glo底物,操作步骤,试剂制备简单将Dual-Glo萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo萤光素酶底物中用Dual-GloStop&Glo缓冲液按1:100稀释Dual-GloStop&Glo底物所有的缓冲液存于室温,所有的底物存于20C两步加入试剂:加,读,加,读10,000倍信号分离(淬灭),用两个萤光素酶做报告基因Chroma-LucTM载体Chroma-Glo检测试剂,E.Coli表达的Chroma-LucTM基因,Chroma-LucTM基因和载体,三个基因:1.CBRluc发红光的萤光素酶2.CBG99luc发绿光的萤光素酶99.0%DNA相同于CBRluc3.CBG68luc-发绿光的萤光素酶68.9%DNA相同于CBRluc两种载体骨架:1.对照置换了pGL3-Control的luc+(pCBR-Control,pCBG68-Control,andpCBG99-Control)2.Basic置换了pGL3-Basic的luc+(pCBR-Basic,pCBG68-Basic,andpCBG99-Basic),合成的Chroma-LucTM萤光素酶载体骨架,ControlBasicEnhancer,SV40启动子,SV40增强子,SV40增强子,(合成的或天然的基因),Chroma-Glo检测的化学,Luciferin,+ATP+O2,Luciferase,Oxyluciferin+AMP,+PPi+CO2+Light,Luciferase:Monomeric,61,000Daltons,Co-substrates:ATP.Mg2+,Luciferin:,不同颜色，同样试剂？,C2,C2,旋转，较少能量，红光,不旋转，较多能量,黄绿光,Chroma-LucTM萤光素酶滤光片选择,510/60nm,610nmLongpass,Chroma-Glo检测的特点,为高通量检测设计，检测96-、384-孔板均质检测需要带滤光片的萤光发光计,pGL4:ANewFamilyofReporterVectors,Nextgenerationreportervectors(pGL4),ImprovedReporterPerformance,ImprovedExpressionofluc2,Provides5-10 xhigherexpressionthanluc+inmammaliancells,Largereductionofconsensussiteswhereinappropriateinteractionswithhostmayoccur,Sitesremovedfromvector,reportergenes,andselectablemarkers:RestrictionsitesVertebrateTFbindingsitesPromotermodulesEukaryoticspliceacceptoranddonorsitesEukaryoticpolyAsitesKozaksequences,ReductioninConsensusBindingSites,IncreasedResponseUsingRapidResponseLuciferases,Comparedtoregularluciferase,RapidResponseluciferasesgavehigherinductioninshortertime.,Inductionat3h,192,79,150,为什么需要快速反应萤光素酶基因？（现存报告基因的缺点）研究者想要报告基因应答与细胞事件在时间上更快地耦联需要更强的应答较长的敷育时间可能导致检测到次级效应(假阳性),RapidResponseTM报告基因技术(不稳定的萤光素酶基因),细胞内报告基因池,信号,新表达的报告基因,为什么快速应答的报告基因应答性更强?,快速应答,非-快速应答,新表达的报告基因,信号,基于报告基因稳定性的动力学模型,pGL4RapidResponseReportersGeneDesign,VectorGeneDesignpGL4.10luc2luc2pGL4.11luc2Pluc2PpGL4.12luc2CPluc2CPpGL4.70hRluchRlucpGL4.71hRlucPhRlucPpGL4.72hRlucCPhRlucCP,快速应答报告基因的设计,蛋白降解序列来自PEST鼠鸟氨酸脱羧酶的序列(40aa)来自酵母CL1序列(18aa)RNA降解序列根据saimiri疱疹病毒小核RNA合成的富AU因子(ARE)萤光素酶基因为哺乳动物细胞表达优化了密码子优化了翻译起始序列(如,Kozak序列)缺失了多数已知的转录因子保守结合位点序列,NewMultipleCloningRegion,pGL4载体系列的优势,更亮的萤光Codonop