双向电泳的技术流程和样品制备

,早上好！,许冰莹,Tel13769175605Email:bingying_xu,昆明医科大学法医学院,第十章血清型（serumtypes）,教学内容和目的要求：（Teachingcontentsandrequirements）,1.熟悉血清型的概念、分类、分型原理、法医学意义。（Serumtypeofconcept,classification,typingprinciple,Significanceofforensicmedicine）2.了解HP的生化性质及生物学功能。(UnderstandingofHPofbiochemicalpropertiesandbiologicalfunctions)3.熟悉Hp分型原理、方法。(FamiliarwithHptypingprincipleandmethod),第一节概述(Overviewofserumtypes)第二节结合珠蛋白型（Haptoglobin,Hp）,第十章血清型（serumtypes）,第一节概述(Summary),一.血清型的概念(Conceptofserumtypes)二.血清型的分类与命名(classificationandnamingofSerumtype)三.分型原理(typingprinciple)四.法医学意义（Significanceofforensicmedicine）,血清型的发现历史,1900年Landsteiner发现了第一个血型系统ABO血型1958年法国科学家Dausset从输血中发现了白细胞抗原20世纪60年代用电泳技术检测血清型及酶型20世纪70年代，等电聚焦技术应用,一.血清型的概念(Conceptofserumtypes),人类某些血清蛋白具有遗传多态性，表型有个体差异，称之为血清型。,一.血清型的概念,人类发现的第一个血清型遗传标记是结合珠蛋白。在法医物证学鉴定中应用的血清型主要有：结合珠蛋白（HP）维生紊D结合蛋白（GC）l-抗胰蛋白酶（PI）转铁蛋白（Tf）,二.血清型的分类与命名（Classificationandnaming）,分型依据：分型原理两大类：同种异型遗传标记血清蛋白电泳多态性遗传标记,二.血清型的分类与命名（Classificationandnaming）,1.同种异型遗传标记(AllotypesofGeneticmarker）同一种属不同个体免疫球蛋白抗原性的差异，用免疫学方法测定。免疫球蛋白Gm,Km,Am等。,二.血清型的分类与命名,2.血清蛋白电泳多态性遗传标记（血清型）不同个体血清蛋白的电泳特性的差异。原因：血清蛋白多肽链中部分肽链或个别氨基酸不同，引起电泳迁移率发生变化构成的多态性，用电泳技术分型。,三.分型原理（PrincipleofTyping）,1.免疫学方法（Immunologicalmethods）同种异型遗传标记的分型。以特异性抗体检测同种异型抗原，确定遗传标记的型别。,三.分型原理（PrincipleofTyping）,2.凝胶电泳技术（GelelectrophoresisTechnology）在法医学鉴定中常用。用凝胶电泳技术分析血清蛋白，获得血清蛋白多态性遗传标记。,三.分型原理（PrincipleofTyping）,2.凝胶电泳技术（GelelectrophoresisTechnology）原理：同一种血清蛋白不同表型的蛋白分子一级结构存在差异，分子量和等电点不同，在一定pH的凝胶中和一定的电场条件下，电泳迁移率不同，依据蛋白谱带位置进行分型。,三.分型原理（PrincipleofTyping）,3.DNA分型技术（DNAtypingTechnology）原理：人类基因组编码DNA序列的差异。-不同个体血清蛋白表型的差异。,四.法医学意义(Forensicsignificance),DNA分型有诸多优势，并已逐步取代传统血型，但血清型与DNA遗传标记相比，基因重组率低，突变率低，在亲子鉴定中仍有应用价值。,第二节结合珠蛋白型（Haptoglobin,Hp）,一.Hp的生化性质与生物学功能二.等位基因结构与命名三.群体遗传学调查结果四.Hp分型原理、方法及法医学应用评价,一.Hp的生化性质及生物学功能(biochemicalpropertiesandbiologicalfunctionsofHp),1.生化性质(biochemicalproperties)产生:肝脏合成，属2球蛋白(占2球蛋白总量的1/4)。分子结构:糖蛋白，含糖量约19.8%，由两条链和两条组成。Hpl型与Hp2型之间链不同，链相同。,一.Hp的生化性质及生物学功能,2.生物学功能(biologicalfunctions)(1)Hb中的铁得以再利用(ironofHbtoreuse)红细胞破坏释出HbHp与Hb结合成Hp-Hb复合物被网状内皮系统吞噬使Hb中的铁得以再利用。(2)保护肾脏(Kidneyprotection)形成的Hp-Hb复合物不易被肾小球滤过防止血红蛋白沉积于肾小管，从保护肾脏。,二.等位基因结构与命名(Theallelicstructureandnaming),(一)Hp基因(Hpgene)Hp基因定位16q22.1基因Hp*1：含5个外显子。Hp*2基因：含有7个外显子。包括Hp*1基因第2,4内含子的部分和第3,4外显子的全部，出现大约1.7kbDNA片段的基因内重复，形成了Hp*2基因。,1.7kb基因内重复,Hp*1基因和Hp*2基因结构示意图,(一)Hp基因(Hpgene),Hp*2基因第4外显子中的52位、53位，第6外显子中的111位、112位密码子也具有Hp*1F基因与Hp*1S基因的差别。Hp*2FFHp*2Hp*2FSHp*2SS,(一)Hp基因(Hpgene),Hp普通型基因:Hp*1，Hp*2。Hp亚型基因:Hp*1F,Hp*1S,Hp*2FF,Hp*2FS,Hp*2SS。按孟德尔规律呈共显性遗传.(Mendelslaws,codominantinheritance)。,(二)Hp表型(Hpphenotype),1.普通型(Ordinarytype)Smithies(1955)采用淀粉凝胶电泳技术将不同个体的Hp分为三型:Hpl-1,HP2-1,Hp2-2型。,2.亚型(Subtype),8moI/L尿素使Hpl-1分子中链变性，用巯基乙醇还原后电泳，发现Hp*1基因产物由Hp*1F，Hp*1S两个基因产物组成。可检出6种表型：Hp1S-1S、Hp1S-1F、Hp1F-1F、Hp2-1F、Hp2-1S、Hp2-2。,(三)Hp遗传变异(geneticvariationofHp)1.HpO血液中Hp含量太低，用常规方法测不出Hp表型，称为无结合珠蛋白血症(anhaptoglobinemia）。Hp0型在中国汉族人群中约占0.81%。胎儿血液中测不出Hp，称为HpO型。一般四个月大的婴儿大部分可测出Hp型。,造成个体HpO型的原因：Hp沉默基因存在。Hp沉默基因编码Hp链的基因片段缺失，缺失DNA包含启动子部分，该基因称为Hp*del。基因型为Hpdel/Hpdel。,Why？,三.群体遗传学调查(Populationgeneticsinvestigation)Hp表型分布存在一定种族差异。亚洲人：Hp2-2Hp2-1Hp1-1白人：Hp2-1Hp2-2Hp1-1黑人：Hp1-1Hp2-1Hp2-2,四.HP分型原理、方法(Theprinciple,methodoftyping),1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘、垂直板）(Polyacrylamidegelelectrophoresis)原理：利用聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的分子筛和电场的作用，在凝胶中分离不同型别Hp蛋白。利用Hp-Hb复合物中Hb的过氧化物酶活性，使联苯胺氧化成联苯胺蓝，使谱带显色进行判型。,2.等电聚焦电泳分型Hp亚型(Isoelectricfocusingelectrophoresis),原理：用两性电解质（Ampholine）加入凝胶系统，使处于正负极之间的凝胶形成一个稳定的pH梯度，当蛋白质泳动至它们的等电点位置时，不再带电荷，蛋白质停留在等电点位置保持静止，以此来分离蛋白