激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件

生物物理教研室,陈丽娜,1,激光扫描共聚焦显微镜,（LSCM）,2,授课内容,3,1957年，MarvinMinsky提出共聚焦原理；1978年，Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜；1982年，BIO-RAD公司第一个推出商品化激光扫描共聚焦显微镜；1985年，WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章；1987年，发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。,一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状,4,5,FluoViewFV1000共聚焦显微镜,FV1000系统完美地整合了两套相互独立的扫描模块在一套系统内，在一束激光进行实验刺激的同时，另一束激光实时地对样品进行扫描，从而记录完整的动态变化过程。,美国Meridian公司的ACASuLTIMA312为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。,BIO-RAD公司第七代Radiance2100型激光扫描共聚焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦扫描显微镜,6,7,1）激光光源2）计算机系统3）共聚焦系统4）光学探测系统5）图像分辨率6）扫描方式,激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统,硬件系统,软件系统,1）、ImageAnalyze2）、RatioAnalysis和Kinetics3）、CellCellCommunicationandFRAP,4）、CellList5）、CellSorting6）、ConfocalImaging,8,Mitoticcells,multiplefluorescence(NCIMaryland),9,10,1、LSCM的基本结构,荧光显微镜系统及样品台,激光光源,扫描器,图象存储及处理系统,LSCM各部分相互关系示意图,计算机控制系统,控制,11,共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较,12,LightMicroscopy,AC.elegansEmbryoGatpro-nucleimeetingGstage(beforedividinginto2-cellembryo),DifferentialInterferenceContrast(DIC;Nomarski),LaserScanningConfocalMicroscopy(LSCM),MultiphotonFluorescenceExcitationMicroscopy(MPFE),13,2、LSCM的工作原理,激光束,扫描器,接收器,计算机,载物台的升降,“光学切片”,“细胞CT”,14,LSCM组成光路的示意图,15,Beampathintheconfocallaserscanningmicroscope,16,共聚焦原理示意图,17,18,（一）激光光源,（1）、激光谱线,（2）、激光器开闭和电压调节,（3）、激光强度回馈稳定电路设计,（4）、辅助设备,19,20,（二）扫描器,扫描器,针孔光栏（pinhole）,分光镜,发射荧光分色镜,检测器,21,1）针孔光栏,2）分光镜,作用,位置,22,3）发射荧光分色镜,4）检测器,23,扫描装置,光束扫描,台阶扫描,扫描方式,原理,优缺点,24,25,扫描系统,（1）、激光扫描系统通过照相通道或荧光通道和显微镜相连，与所接显微镜一体化设计,（2）、检测器数量,（3）、共聚焦针孔,（4）、扫描分辨率及灰度级,（5）、连续分光设计系统（或其它光谱分离系统）,50-300微米,（6）、光谱扫描功能,（7）、扫描速度及速度调节,26,（8）、扫描方式,XYZt任意组合点扫描线扫描X扫描平面扫描XY、XZ扫描xyz,xyzt扫描局部放大扫描光谱模式下，多通道同时扫描。,（9）、扫描旋转、光学放大（变倍）,（10）、可即时或延时进行扫描,（11）、有线和帧方式的多重扫描功能,ROI(regionofinteresting，感兴趣区域）,实时（realtime）显示,27,（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无须很复杂地对仪器参数重新设置,（13）、有记忆功能,（14）、有专用的图象数据库,（15）、系统采用模块化设计，便于整个系统的扩展和升级换代,28,29,30,（三）光学系统（显微镜）,、倒置荧光万能显微镜,、显微镜上的外接接口,、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达,、荧光镜座要装有防振动装置,、装有光路转换装置,、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜,、载物台支架和附件的配置,31,(10)、4位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆盖紫外和可见光波长,、荧光显微镜的参数要与光路系统、计算机控制软件系统相匹配,、汞灯光线的强度可调,32,33,荧光源,单光子激励（左），多光子激励（右）,激发荧光能量图,34,单光子（1）,单光子（2）,双光子（2）,单、双光子激发产生荧光过程的示意图,35,荧光光谱,36,37,分隔发射的荧光,38,Separationoffluorescenceemissionsbymeansofdichroicfilters,39,（四）计算机系统,控制硬件的软件功能：控制电动显微镜；选择激光波长，调节激光强度；拍摄2-5维图像；选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片位置。,40,应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用等）：多通道叠加，三维重建，旋转，生成AVI文件，Average拍摄模式提高信噪比；荧光强度动态分析，动态显示，Ratio值测量（钙离子等）；FRAP/FLIP；线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；图像调节亮度，对比度，Gamma；单个通道分别调节或多个通道同时调节；图像处理：旋转，裁剪，多种滤镜（Kirsh/Laplace/Lowpass/Median），添加标尺，箭头，文字等；图像分析：直方图，距离，强度，强度断面分布；VBA模块：宏功能，可以录制，编辑，回放，实现自动操作；多种视图：1D，2D，正交视图，图片叠加等；光谱分析具有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能量共振转移）软件包。,41,42,三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤,（一）样品制备,1组织切片标本实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。,2细胞标本细胞种类和纯度，细胞密度和形态。,3承载细胞的器皿Petri皿和玻片。,43,44,（二）荧光探针的选择,标记生物样品的探针大约分为：,1）蛋白质、单糖和多糖探针；,2）细胞器探针；,3）核酸探针；,4）细胞活性探针；,5）膜和受体探针；,6）细胞膜电位和细胞内pH探针；,7）金属探针；,8）分子的特殊基团结合探针；,9）其他,45,46,47,（4）、按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。,（三）仪器使用步骤,（1）、选择激光器类型,（2）、选择相应的滤片,（3）、根据实验目的选择适当软件,48,49,50,51,52,53,1、“更多信号！”1）、通过减慢扫描速度2）、使用“平均”方法3）、增加发射滤镜的带宽4）、加大针孔直径；注意：光学切片的厚度也会相应地增大。5）、增大激发能（激光功率）；注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。,如何改善图像质量,54,3、“更可靠！”1）、使用多轨2）、提供预定义配置。3）、可同时定义和使用任何形状的多个研究区。,2、“更多细节！”1）、使用较高数值孔径(NA)的物镜2）、增加“帧大小”=每条线的像素值+每帧的线条数3）、优化扫描焦距(Z)4）、增加动态范围,55,56,57,Culturedcells,multiplefluorescence(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZrich),58,四、激光扫描共聚焦显微镜的基本功能,59,（一）采集和处理图像,1、无损伤逐层扫描样品采集二维及三维荧光图像,LSCM的成像特点：,（1）、保持样品的完整性。（2）、采集多重（波长）荧光分解及合成（overlay）图像。（3）、所采集的荧光图像比普通荧光显微镜质量好，更利于形态学观察。（4）、可以只选择出样品中感兴趣的区域（regionsofinterest，ROI）和深度进行扫描。（5）、获取三维重建图像,2、获取透射光及反射光图像,有、无荧光的样品均可以用LSCM采集到其透射光图像。,60,（二）荧光分子的定性及定位,1、定性鉴定待测荧光物质,2、荧光信号的定位,（1）、单荧光定位,（2）、多重荧光标记共定位,（3）、荧光与透射光共定位,61,Confocalmicrographofmilkshowingmilkprotein(green),fat(blue),sugarcrystals(black)andcocoasolids(red).Bar=25mm,62,63,64,65,（三）定量测定,LSCM将所采集的共聚焦图像中的相关信息转化为定量数据，即称之为定量测定。,（1）图像中的任意区域（或线）的荧光强度。,（2）荧光强度随着时间、空间和波长的变化曲线和数据。,（1）图像中的任意区域（或线）的荧光强度,（3）图像内的几何参数，包括面积、厚度、空间距离、体积等。,按照定量测定中是否含有时间控制程（t），将扫描模式分为动态检测和静态测量。,66,67,ThefigureshowsCa2+responsetoNAADPuncaginginmatureAsterinapectiniferaoocytesmeasuredwithconfocalmicroscope.,68,（四）LSCM可获取的图像种类,LSCM将所采集的光学图像分为两种：荧光图像和光镜图像。1）单独采集荧光和光镜图像；2）分通道道同时采集多重荧光图像和透射光图像，通过这些图像相互组合，同时展示在一幅画面上；3）按照空间（三维）、时间或波长顺序采集图像，通过这些图像组合则可完成断层扫描、三维重建、时间动态实时检测及波长扫描等功能，从而实现空间分辨、时间分辨和波长分辨。,69,显微观察方式,70,71,72,73,74,（五）光谱交叉干扰及其消除,两种以上荧光探针之间，如果荧光发射峰很近，荧光光谱彼此会有部分重叠，这种现象称谓光谱交叉（crosstalk）；一种荧光探针的荧光信号扩散到另一荧光探针的检测通道，造成光谱交叉干扰。,75,76,避免或排除光谱交叉干扰的方法,1）、同时使用几种荧光探针时，尽量选择相互之间无光谱交叉的荧光探针。2）、降低标记荧光强度。（采用降低标