第十六章转基因技术与作物育种(一)

1,第十六章转基因技术与作物育种,2,作物转基因育种就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。转基因作物（GMC，geneticallymodifiedcrops）,什么是转基因育种?,3,Traditionalcrossbreeding,RecombinantDNAtechniques,4,与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：1.拓宽可利用的基因资源；2.培育高产、优质、高抗优良品种提供了崭新的育种途径；3.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择；4.可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。,5,一、转基因技术的发展现状,第一作物的转基因技术,自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。,国际农业生物技术应用服务局（ISAAA）统计结果,6,世界银行下属机构预测，世界范围内转基因作物产业的交易额：2010年达到200亿美元，1500万农民种植转基因作物种植国家先后有30多个国家批准了3000多例田间试验，涉及的植物种类有40多种；2000年有13个国家种植商品化转基因植物；2004年有17个国家种植商品化转基因植物。,7,美国：3900万公顷加拿大：350万公顷阿根廷：1350万公顷中国：210万公顷,8,转基因作物种类主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，以转基因大豆面积最大。,目标性状抗除草剂：2000年使用抗除草剂大豆、玉米和棉花占转基因作物74%。抗虫和抗病毒病：2000年，Bt玉米、Bt棉花占19%。耐除草剂+抗虫性双价的转基因棉花和玉米占7%。,9,我国转基因作物研究与利用概况我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60，产量比对照增加15，产值增加20，1992年每亩增收200元，遗憾的是由于市场的原因现已不推广。,到1999年我国已批准中试的转基因作物有48项：包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种作物。,10,经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有：我国自行研制开发的抗虫转基因棉花（转Bt及Bt+CpTI双价抗虫棉）；2004年种植转基因棉花370万公顷，占棉花种植面积的50%美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉；延迟成熟期的转基因番茄；抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄；抗CMV转基因甜椒；转查尔酮合酶（CHS）反义RNA基因矮牵牛。,11,由中国农科院生物工程中心开发的Bt棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量80，并减少用工150个/hm2，以上两者可使每公顷节省1500元，Bt转基因棉种深受棉农的欢迎。,12,分离目的基因,重组到某中间载体,转化大肠杆菌,提取质粒,限制酶切/连接,克隆到植物表达载体,转化农杆菌,基因枪转化,pKS,pBR332,pGEM-T,JM109,TOP10,HindIII/EcorIT4ligase,pBI121,pCAM1001,LBA4404,EHA,安全性评价,转基因品种,市场开发,第二、转基因育种的程序,13,基因工程四大要素工具酶载体目的基因受体细胞(宿主细胞),14,(一)工具酶1.限制性内切核酸酶,一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。,一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。,15,最适温度37,2.DNA连接酶（ligase）,能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。,DNA连接酶反应温度,一般采用16-20。,16,承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛选克隆子。,(1)多克隆位点(MCS，multiplecloningsite),(2)复制原点(ORI,origin),(4)安全,能使外源DNA片段插入,能进行自我复制,(3)选择标记基因,(二)载体：能承载外源基因，并将其带入宿主细胞(hostcell)得以稳定维持的DNA分子。,载体具备的条件,17,载体的分类,按功能分类克隆载体：克隆一个基因或DNA片断表达载体：用于一个基因的蛋白表达整合载体：把一个基因插入到染色体组中按来源分类质粒载体(plasmidvectors)病毒或噬菌体载体(phagevectors)柯斯质粒载体(cosmidvectors)人工染色体载体(B/Y/HAC),18,(一)质粒载体,质粒(plasmid),染色体外能自我复制的双链闭合环状DNA分子，,广泛存在于细菌细胞中。,松弛型复制质粒,在寄主细胞内，能复制几百上千个拷贝。,严紧型复制质粒,在寄主细胞内，只能复制少数几个拷贝。,质粒分类(拷贝数),A克隆载体,19,外源基因插入的多克隆位点(MCS),构建质粒载体,一般选用分子小的松弛型复制质粒,应具有复制起始点(ori)，能够在受体细胞内复制。,此外，质粒还有2个以上的选择标记基因(ampr、Kanr、Cmr、tetr、lacZ),20,1、大肠杆菌质粒载体,(1)pBR322质粒,21,氨苄青霉素(ampr，pSF2124质粒易位子Tn3),pMB1(类似ColE1质粒，具大肠杆菌素E1合成酶基因),四环素抗性(Tcr，pSC101)基因,复制原点,选择标记基因,tetr,ampr,Ori,22,多克隆位点(multiplecloningsite),Tcr内有11个限制性内切酶位点，其启动子内2个,64个限制性内切酶位点,Apr内有6个限制性内切酶位点,23,24,大肠杆菌-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及编码-半乳糖苷酶-肽链的DNA序列(LacZ基因),(2)pUC质粒载体,Messing&Vieria(UniversityofCalifornia)1987年构建,pBR322质粒的复制起点(ori),氨苄青霉素抗性基因(ampr),LacZ内有13个酶切位点的多克隆位点(MCS)。,lacZ,25,26,乳糖操纵子模型调节基因启动子操纵子结构基因表达转录,I,CAP,P,O,Z,Y,A,阻遏蛋白结合部位,RNA聚合酶结合部位,多顺反子mRNA,阻遏蛋白,27,-半乳糖苷酶,-片段,-片段,含LacZ基因的载体,大肠杆菌缺陷株,LacZ基因,IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷(诱导物),X-gal:5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(底物),IPTG,28,BlueWhite蓝白斑筛选,ampr,ampr,Insert,Noinsert,lacZ,lacZ,29,互补的检测,-片段,-片段,30,蓝白斑筛选的原理*-互补(alpha-complementation)野生型的大肠杆菌所产生的-半乳糖苷酶，可以在IPTG诱导下和其底物X-gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。然而，人工构建的大肠杆菌缺陷株系只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有编码该酶-片段的lacZ基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能(发生显色反应)，这种现象被成为是alpha-complementation。蓝白斑筛选添加IPTG以激活LacZ基因中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA(即目的片段)与含lacZ基因的载体连接，一旦插进该基因中的MCS，使-片段读码框破坏，这种重组质粒不再表达-片段，将它导入宿主互补菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，表型为白色菌落。实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素。这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。,31,有多克隆位点,酵母穿梭质粒载体,(3)穿梭质粒载体(shuttlevector),指既能在原核细胞也能在真核细胞中复制繁殖的载体,有细菌质粒的复制原点(ori)及选择标记基因,有真核生物的自主复制序列(ARS)和选择标记基因,蓝藻穿梭质粒载体,32,(4)T-克隆载体,线状的,33,MCS,34,(二)噬菌体和病毒载体,1、噬菌体载体,线状双链DNA全长49kb(48502bp),35,DNA进入寄主细胞后，含有12个核苷酸的粘性末端互补配对形成双链环状分子，结合处称为cos位点。,噬菌体的特点,1)具cos位点,(cohesiveend,cos),作用：识别噬菌体的外壳蛋白，是噬菌体包装的必需序列。,36,DNA可以整合到寄主细胞染色体，以溶原状态存在，并随染色体的复制而复制。,2)是温和型噬菌体,当紫外线或45处理，释放出DNA，被外壳蛋白包装，成为溶菌状态迅速增殖。,37,噬菌体能包装原DNA长度的75-105%，约36.4-51kb。,3)中间为非必须区,不进行改造，允许承载2.5kb(约5%)的外源DNA。,中间有约20kb的区域对噬菌体生长不是绝对必须的。,38,4)D、E包装必须基因,39,5)DNA上具多个限制性内切酶识别序列,40,3、柯斯质粒(cosmid)载体,(1)柯斯质粒,“cosmid”一词是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的。,所谓柯斯质粒，是一类由人工构建的含有DNA粘性末端位点(cos)序列和质粒复制子(ColE1、pMB1)的特殊类型的质粒载体。,41,(2)柯斯质粒载体的特点,1)环状dsDNA分子，一般在10kb以下。2)具有噬菌体的特性：含有一个cos位点，可以高效地转导对噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。3)具有质粒的性质：能承载外源片断，转化大肠杆菌，并在其中自行复制和维持。4)便于筛选：携带质粒的选择标记。5)具备高容量的克隆能力：分子量较小，能承载比较大的外源片断，40kb，被广泛地应用于构建基因组文库。6)不会产生子代噬菌体：不含溶菌生长途径。,42,自主复制序列(ARS，一个或多个)autonomouslyreplicatingsequences,(三)人工染色体克隆载体,1、酵母人工染色体,染色体(Chromosome)的结构元件,着丝粒(CEN),端粒(TEL，两个),或称为自主复制序列(ARS),人工染色体：能在宿主细胞中稳定复制，并准确传递给子细胞的人工构建的染色体。,43,YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具,44,2、细菌人工染色体(BacteriaArtificialChromosome,BAC),细菌细胞内能自我构建复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段,F因子,45,克隆载体的种类和特征,46,B表达载体,克隆载体（cloningvector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；表达载体（expressionvector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；,47,48,一、原核生物基因表达的特点1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16SRNA3末端碱基互补的序列，即SD序列。,49,二、真核生物基因表达的特点1.基因组DNA的存在形式可影响基因表达2.转录与翻译不偶联3.调控是多层次的4.具有组织和细胞类型特异性5.对信号分子反应不同,50,(一)、原核表达载体,原核生物基因表达载体的组成特征1.启动子2.核糖体结合位点(SD序列)3.终止子4.选择标记基因5.复制子原核生物基因表达的受体系统大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统链霉菌受体系统,51,大肠杆菌表达载体的基本成分,52,(二)、真核表达载体,真核生物基因表达载体的组成特征1.DNA复制起始区2.启动子组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、杂合启动子3.增强子4.终止子5.内含子6.polyA加尾信号7.选择标记基因和报告基因,酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统昆虫杆状病毒表达系统、植物细胞表达系统,真核表达载体类型,53,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,54,55,可诱导植物产生瘤细胞(Tumor-inducing,Ti)，,3.Ti质粒(Tiplasmid)载体,一种细菌质粒,存在于土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中,冠瘿瘤(growngalltumors)。,56,农杆菌与植物细胞相互作用的机制,57,根据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，可以分成四种类型：,1)Ti质粒的类型,农杆菌素碱型(agrocinopine),章鱼碱型(octopine),胭脂碱型(nopaline),农杆碱型(agropine),或称琥珀碱型(succnamopine),58,该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关,T-DNA区转移DNA(transferred-DNAregion),农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA,59,该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性,Vir区毒区(virulenceregion),T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一,60,该区段上存在细菌间接合转移的有关基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。,Con区接合转移编码区,冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移,(conjugationencodingregion),61,该区段基因调控Ti质粒的自我复制,Ori区复制起始(originofreplication),62,一元表达载体又称共整合载体(cointegratevectors)系统,需要同源重组才能插入外源基因。,pGV3850是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。,3)Ti质粒载体的构建,63,一元表达载体,外源基因插入pGV3850的过程,64,双元表达载体：由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。辅助Ti质粒(又称卸甲Ti质粒)：含有Vir区，用于激活T-DNA的转移。(由经改靠的农杆菌EHA105、LBA4404提供)微型Ti质粒：含T-DNA边界，缺少Vir区，是一种穿梭载体。(如pBIN19,pBI121),65,构建原理：将微型质粒转入到含有辅助性Ti质粒农杆菌的途径有两条：一条是直接用纯化的微型Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条途径是采用三亲交配方法。三亲交配由含微型Ti质粒的E.coli、含有助动质粒pRK2013的E.coli和含有辅助Ti质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌间的接合转导。pRK2013可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型Ti质粒的E.coli后，可促进微型Ti质粒一起或分别转入农杆菌中。由于pRK2013的“自杀”特性，最终在农杆菌中剩下含有微型Ti质粒和辅助Ti质粒的双元载体，此农杆菌可直接用于植物细胞转化。优点：双元载体无需两个载体的共整合过程，因此构建的操作过程比较简单；由于微型Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，且构建的频率较高。另外，双元载体在外源基因的植物转化中效率高于一元载体。,66,一元载体,双元载体,67,(三)目的基因：基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和得到表达产物的基因。,目的基因一般为结构基因，也就是能转录和翻译出多肽(蛋白质)的基因。,68,根据获得基因的途径主要可以分为两大类：根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆；从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。,1.根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆主要步骤如下：利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局限性：兼并密码子效率低未知基因及产物,分离蛋白质,明确氨基酸序列,推导核苷酸序列,人工合成,功能鉴定,69,2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因,(1)同源序列法(HomologyBasedCandidateGeneMethod)根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。,氨基酸序列比较,设计简并引物,PCR扩增,文库筛选/RACE,70,71,引物（primer）:是一段特定的DNA序列，在退火温度下和模板链特异性结合，引导PCR体系中的dNTP根据碱基配对原则延伸出一条新的链。,72,Oligo(dT)随机引物：RAPD特异性引物：SSR、ISSR、SRAP、Scot通用引物：一般和载体多克隆位点两旁的序列匹配简并引物：是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。,引物种类,73,(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过cDNA的途径获得。获得EST的途径:大规模cDNA文库测序各种mRNA水平的分析手段,mRNA,cDNA,反转录酶,cDNA文库,PCR,差异显示,抑制消减杂交,EST,RACE/文库筛选,dbEST,GenBank,74,(3)根据连锁图谱克隆目的基因图位克隆技术(Map-basedcloning),75,先将目的基因(目的基因的突变)定位到染色体上，并在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的分子标记；,接着利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移将位于这两个分子标记之间含目的基因的特定基因组片段克隆并分离出来；,最后根据其同突变体发生遗传互补的能力从此克隆中鉴定出目的基因。,76,Ma