第四章-蛋白质结构解析

第四章蛋白质结构解析,人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动？,人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角色。人体中大约有10万种蛋白质。,测定蛋白质结构的意义,蛋白质三维结构解析方法X-射线晶体衍射法：85.3%核磁共振波谱：14.7%电镜三维重构、各种光谱技术、显微技术和计算机模拟,蛋白质三维结构解析过程,X-Ray晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法。优点：分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性中心的位置和结构缺点：只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息,1895年11月8日,德国物理学家，50岁的伦琴在自己的实验室中偶然发现一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，由于对管子发出的“东西”性质不确定，伦琴就把这种射线命名为“X射线”。,图片出处:,伦琴实验室,第一节X-射线衍射测定蛋白质结构,人类第一张X光照片1895年11月22日,图片出处:,伦琴妻子之手,1896年1月23日伦琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报告。与会的Kolliker教授提议将该射线命名为”伦琴射线”但伦琴却说：“我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还是称它为X射线最恰当。”,威廉康拉德伦琴WilhelmConradRntgen,1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有17封集中推荐他。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金。,图片出处,诺贝尔物理奖奖章,X射线本质,X射线是一种短波长(0.00510nm)、高能量(2.51051.2102eV)的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。,一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X射线的真空管，K是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极A撞击而产生X射线。,A,X射线衍射,1912年MaxvonLaue发现X射线具有衍射的现象。（1914年的诺贝尔物理学奖）,图片出处:,劳厄的实验装置,图片出处:,X射线通过红宝石晶体(a)和硅单晶体(b)所拍摄的劳厄斑,图片出处:,劳伦斯布拉格(LawrenceBragg),亨利布拉格(HenryBragg),因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献,亨利布拉格（WilliamHenryBragg）和劳伦斯布拉格（WilliamLawrenceBragg）父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。,图片出处50/nobel/nobel1.htm,图片出处/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.html,20世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获得诺贝尔奖；20世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成为轰动世界的新闻；20世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；20世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。,蛋白质结构解析的发展,饶子和院士,HIV基质蛋白,SARS,射线衍射用于蛋白质结构的测定,1954年伯纳尔(Bernal)获得第一张胃蛋白酶晶体衍射图片。,1957年肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白的0.6nm分辨率的蛋白质晶体结构,图片出处:http:/www.drg.de/data/wuerdigungen/Nobelpreise/RoenNobel.htm,图片出处:http:/www2.mrcmb.cam.ac.uk/archive/gal/source/kendrew.html,x-射线衍射测定蛋白结构,图片出处:,X-射线晶体结构分析基本原理,X射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象。X射线衍射现象利用X射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离、键角，分子的立体结构、绝对构型、原子和分子的堆积、有序或无序的排列以及非计量的程度等。,肌红蛋白的三维结构,肌红蛋白的三维结构模型,图片出处:,图片出处:http:/www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/archive/Kendrew62.html,1959年佩鲁茨(Perute)完成血红蛋白0.55分辨率的晶体结构,图片出处:http:/www.hsgq.pudong-,血红蛋白的四级结构模型,图片出处,血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的亚基和二个由146个氨基酸残基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。,由于测定出蛋白质的精细结构,两位英国科学家M.F.佩鲁茨和J.C.肯德鲁获得1962年的诺贝尔化学奖。,图片出处：,蛋白质X射线晶体结构测定程序,蛋白质晶体结构的X射线衍射分析包含五个主要步骤：1、样品制备2、蛋白质结晶和晶体生长3、衍射数据收集和处理4、位相求解5、模型建立和修正,X-射线晶体衍射法的发展无论从结构测定的方法还是从结构测定所用的仪器都有了飞跃的发展。第三代同步辐射光源的应用使得用20-40um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实。目前世界上比较著名的同步辐射工作站有多个：APS（USA）;ESRF（France）;SPring-8（Japan）,成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成为一种引人注目的癌症早期诊断技木。,第二节NMR测定蛋白质结构,核磁共振技术（NMR）,1946年美国斯坦福大学的F.Bloch和哈佛大学的E.M.Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。,1983年，瑞士科学家KurtWthrich教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液构象.瑞士科学家KurtWthrich因为发明了利用核磁共振(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了2002年度诺贝尔化学奖,74岁的美国科学家保罗劳特布尔和70岁的英国科学家彼得曼斯菲尔德为2003诺贝尔医学奖的得主,NMR基本原理,核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时,共振吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。,核磁共振波谱仪,核磁共振波谱是测量原子核对射频辐射(约4600MHz)的吸收，这种吸收只有在高磁场中才能产生。,核磁共振波谱仪,核磁共振波谱仪,1永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。2射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。,3射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。,4样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转,磁场作用均匀。,二维核磁共振(2DNMR）,NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2个频率变量的函数，吸收峰对2个频率变量作图。,如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图形。同样，如图所示，通过测量蛋白质中的大量的短距离，就可以画出其结构的三维图像。,瑞士科学家库尔特维特里希则发明了“利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构法”。这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析,进而可对活细胞中的蛋白质进行分析,能获得“活”蛋白质的结构,其意义非常重大。这种方法的原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位,据此就可以推知房屋的结构。维特里希选择生物大分子中的质子(氢原子核)作为测量对象,连续测定所有相邻的2个质子之间的距离和方位,这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。,多维核磁共振,可以把一维谱中的重叠峰在二维或三维方向展开，便于NMR谱的解析。还能间接检测到在普通NMR方法中得不到的多量子跃迁,核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部的图像，就要将不同梯度的磁场加以结合，即改变穿过样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像,核磁共振技术的应用,早期核磁共振主要用于对核结构和性质的研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等后来广泛应用于分子组成和结构分析，生物组织与活体组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面,1985年,维特里希等人公布了第一次利用NMR法测定的溶液中蛋白质蛋白酶抑制剂IIA(proteinaseinhibitorIIA)的结构,NMR图谱得到的蛋白质三维结构,from：厦门大学生命科学学院,NMR的非破坏性使得NMR谱图可以确定完整生物大分子中某成分的存在和浓度从而与X-Ray晶体衍射互为补充.,核磁共振成像,基本原理：是将人体置于特殊的磁场中，用无线电射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核共振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像.,核磁共振测深,核磁共振测深是MRI技术在地质勘探领域的延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构信息。,优缺点,优点：可以在水溶液或有机相中研究生物大分子结构，研究溶液条件的改变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内部动力学的特点,缺点：分辨率不高。目前，NMR只能用于测定小分子和中型蛋白质的结构,from：厦门大学生命科学学院,NMR法测定蛋白质结构的基本实验步骤:,1、样品制备，一般应采用液态样品2、一维NMR实验3、二维NMR实验4、三维NMR实验5、有的还要做四维NMR实验,X-射线晶体衍射法、核磁共振波谱的关系NMR法一般只能解析相对较小的蛋白质，X-射线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。有些蛋白质水溶性很差，却很容易培养成晶体，另一些蛋白质则水溶性很好，培养成晶体很困难。,第三节蛋白质结构测定的其他方法,X射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法，但它们都存在一些不足。X射线晶体衍射技术要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂。,因此，下面介绍一些其他测定蛋白质结构的方法：现代光谱技术三维电镜衍射技术动力学全精研究技术,一、现代光谱技术,除传统的紫外-可见差光谱法和荧光光谱法外，圆二色谱、激光拉曼光谱以及质谱也在测定蛋白质溶液构象方面发挥着重要的作用。,圆二色谱（CircularDichroism，CD）,圆二色谱是研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。1969年，Greenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多。,平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光,平面偏振光：指振动方向在同一平面内的电磁波。圆偏振光：当两束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差1/4波长(90)时，其合成矢量绕光传播方向旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量E末端轨迹为圆形，所以称之为圆偏振光。电场矢量方向顺时针方向旋转的称为右圆偏振光，逆时针方向旋转的则称左圆偏振光。平面偏振光：即由振幅相等的左、右圆偏振光合成,圆二色性和圆二色谱,圆二色性：当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的光成为椭圆偏振光，用椭圆度或吸收差表示圆二色谱：指椭圆度(或比椭圆度等)与波长的关系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。,圆二色谱的应用,在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定生物大分子的空间结构。生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子，通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构。,蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子，主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫键，另外，有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性有影响。,肽键的不对称性使得它总有光活性,蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围:1）250nm以下的远紫外光谱区，圆二色性主要由肽键的n*电子跃迁引起；远紫外CD主要应用于蛋白质二级结构的解析2）250300nm的近紫外光谱区，主要由侧链芳香基团的*电子跃迁引起；近紫外CD主要揭示蛋白质的三级结构信息3）300700nm的紫外-可见光光谱区，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。紫外-可见光CD主要用于辅基的偶合分析。,肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外CD谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。,-螺旋结构在靠近192nm有一正的谱带，在222和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；-折叠的CD光谱在216nm有一负谱带，在185200nm有一正谱带；-转角在206nm附近有一正CD谱带，而左手螺旋P2结构在相应的位置有负的CD谱带，如上图和表所示。,CD数据拟合计算蛋白质的二级结构的方法基本原理是假设蛋白质在波长处的CD信号()是蛋白质中或多肽各种二级结构组分及由芳香基团引起的噪音的线性加，()=fi()i+noise。()i是第i个二级结构成分的CD信号值，fi为第i个二级结构成分的含量分数，fi规定值为1；通过已知蛋白（或称参考蛋白）二级结构的圆二色数据库，曲线拟合未知蛋白或多肽的圆二色数据，估算未知蛋白或多肽的二级结构。,蛋白质或多肽的二级结构拟合计算方法中，主要采用多聚氨基酸为参考多肽。Greenfield等采用多聚L-lys作参考多肽，建立-螺旋、-折叠及无规卷曲等二级结构参考CD光谱曲线，采用单一波长法（208nm）计算出-螺旋含量后，然后假设不同的-折叠含量（X）值，并假设CD值是-螺旋含量(XH)、-折叠含量(X)无规卷曲(XR)三者贡献值的加和，即：XH+X+XR=1,通过计算得到不同波长的()，得出计算曲线。假设一些不同的X值，分别求出它们相应的计算曲线，找出与实验曲线最接近的曲线，相应于该最接近曲线的X及XR即认为是该蛋白质的相应结构含量。,Examplefit:myoglobin(肌红蛋白),Inthiscase:qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwithxa=80%,xb=0%xc=20%agreeswellwithstructure78%helix,22%coil,激光拉曼光谱,激光拉曼光谱法是研究生物大分子结构、动力学及功能的重要手段，它在物理、化学、医学及生物学等领域都有着十分重要的应用价值。在蛋白质等结构研究方面，拉曼光谱分析可以提供大量的信息，促进蛋白质等生物大分子研究进展。,1928年，印度物理学家拉曼(Raman)发现了拉曼光谱，同时期的苏联物理学家兰斯伯格(G.Landsberg)也独立地发现了这一现象。从那时起，拉曼光谱逐渐发展成为一个分析物质结构的有力工具。然而由于拉曼光谱技术强度很弱，时间较长，测定有色物质和发光样品存在困难等缺陷,给其应用带来了很大困难,故在后来很长一段时间内发展比较缓慢，曾一度有被红外光谱取代的趋势。直到1960年激光出现以后，由于激光具有高亮度、单色性和方向性好以及高偏振度等特点，非常适合作为拉曼光谱的激发光源，因而迅速为科研工作者所利用。,质谱(massspectrometry，MS),自美国科学家JohnB.Fenn和日本学者田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。生物质谱的发展使人类基因组计划及其后基因组计划得以提前完成，对其实施也起着重要的推动作用。质谱分析法在研究生物大分子特别是蛋白质方面已发展成为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十分重要的地位。,质谱分析基本原理,质谱分析是将样品转化为运动的气态带电离子，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。其过程可简单描述为：离子源轰击样品带电荷的碎片离子电场加速(zeU)获得动能(mv2)磁场分离检测器记录其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，v为电子运动速度。,质谱分析(MS)的特点,MS用于生物大分子的研究具有以下优点:高灵敏度易操作性准确性快速性很好的普适性高灵敏度能为亚微克级试样提供信息，可以有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定。,质谱分析的方法,近年来出现的较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：电喷雾电离质谱基质辅助激光解吸电离质谱快原子轰击质谱离子喷雾电离质谱大气压电离质谱在这些技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛。,蛋白质的质谱分析,质谱分析目前主要测定一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。肽和蛋白的质谱测序具有速度快、用量少、易操作等优点，使它非常适合现代科研工作的要求。蛋白质质谱分析原理为：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。,蛋白质的质谱分析方法,MS用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法：第一种方法称为蛋白图谱(proteinmapping),它是使用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的分子量,将所得肽谱数据输入数据库,搜索与之相对应的已知蛋白,从而获取待测蛋白序列；,第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基；第三种方法称为梯状测序(laddersequencing)，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从端或端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，再经质谱检测，由相邻峰的质量差可知相应氨基酸残基。,质谱中主要出现的离子有四种，即分子离子、碎片离子、同位素离子和亚稳离子,分子离子分子在离子源中失去一个电子形成的离子，在质谱图中，分子离子对应的峰称分子离子峰。特点：分子离子含奇数个电子，分子离子峰出现在质谱图的最右侧。作用：根据分子离子的质荷比可确定分子量及分子式。,碎片离子：分子离子中的某个化学键断裂而形成的离子，有些碎片离子获得能量，会进一步裂解成更小的碎片离子。特点：m/z较分子离子小，碎片离子峰出现在分子离子峰的左侧。作用：反映分子的结构信息。,亚稳离子：离子受电场加速后，在飞行途中碎裂而产生的离子，其对应的峰称为亚稳峰。特点峰弱，强度仅为m峰的1%3%。峰钝，一般可跨25个质量单位。m/e一般不是整数，与母离子和子离子有下述关系：m*m22/m1用途可以确定离子的亲缘关系，有助于了解裂解规律，解析复杂图谱。,例：对氨基茴香醚在m/z94.8和59.2处，出现两个亚稳离子峰（如图），试据此推断离子间的裂解关系。,根据计算：1082/12394.8；802/10859.2，证实裂解过程为：m/z123m/z108m/z80,二、三维电镜重构法(3-dimensionelectronmicroscopyreconstitution),三维电镜重构技术是电子显微束、电子衍射与计算机图像处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电子显微镜在三维电镜重构技术中起着十分重要的作用，电镜二维晶体学在膜蛋白的三维精细结构解析上有着特殊的优势。所谓三维电镜重构是指通过样品的一个或多个投影图得到样品中各组成部分之间的三维关系。,冷冻电镜三维重构的基本技术路线:利用快速冷冻技术对样品进行冷冻固定然后利用冷冻电镜和低剂量成像技术对样品进行