PFGE标准方法1

PFGE标准正向法第一天一、橡胶块的准备1、在falconst2054管中显示样本名称和空白对照组，分别添加约2ml细胞悬浮浊度液(csb)；2，1.5ml在eppendorf管中显示该范例的名称。3、在模具上显示相应样品的名称。4、使用CSB浸泡注射，从培养皿中刮出适量的细菌，使其在CSB中均匀稠。使用BioMerieux Vitek colorimeter测量od值，然后将其调整为3.6至4.5。如果OD值大于4.5，则添加CSB稀释。如果Ods值小于3.6，则增加细菌量以提高浓度。OD是光学密度的缩写，表示被检测器吸收的光的密度，是检测方法的专有名词，检测单位表示为ODS值，表示为1od=1og (1/trans)。其中trans是探测器的半透明值。光通过主体的话，前后的能量差异是被主体吸收的能量，在特定波长下，同一主体的浓度与吸收的能量有定量关系。5，400l细菌悬浮在相应的1.5ml eppendorf管内，在37 的水中孵化养5分钟。剩下的细菌悬浮液放在冰上，直到橡胶准备好摇动水槽为止。6、从水浴箱中取出eppendorf管，在每个管中加入20l蛋白酶K(Merk公司) (保管液浓度20mg/ml)，混合最终浓度为0.5mm/ml。准备就绪1%Seakem Gold(Bio-RAD，bole): 56水浴箱中1%SDS(十二烷基硫酸钠)。SeaKem Gold琼脂糖是高凝胶强度、低EEO、标准胶凝温度的琼脂糖。这种遗传学术水平的琼脂糖是脉冲场凝胶电泳(PFGE)的快速分辨率Mb(megabase)SeaKem Gold琼脂糖的DNA电泳迁移速度远高于传统的琼脂糖凝胶，这是因为电子注射(EEO)的特性。PFGE的跑步时间根据使用的缓冲液和琼脂糖浓度减少到原电泳时间的50%。凝胶强度高，即使使用低浓度(0.5%)的SeaKem Gold琼脂制成的凝胶，操作也很容易，从现有电泳中分离较大的DNA片段，从PFGE中分离DNA可能需要很长时间。1、向eppendorf管添加400l时，1% se akem gold: 1% SDS，用枪轻轻搅拌。(SK=1g 1，90 mlte 10ml 10SDS)2、将混合物放入模具中，在室温下凝固10-15分钟，防止产生气泡。注意事项：(1)使用后，接种环应放入指定的废物容器。(2)细胞悬浮，蛋白酶k应放在冰中。(3)避免混合胞悬浮和1% seakem gold: 1% SDS中产生气泡。(4)混合物加入模具时不能产生气泡。(5)在添加1% se akem gold: 1% SDS的过程中，1% se akem gold: 1% SDS必须继续放在56水浴场中。第二，细胞分解在1，50ml的screw-cap tube上标记。2、细胞分解液(CLB):每5ml细胞分解液中添加25l蛋白酶K(20mg/ml)，使最终浓度为0.1mg/ml，然后反向混合。注意：蛋白酶k要放在冰里，配制的细胞CLB要放在冰里。3、各管加入5ml蛋白酶K/CLB混合物。4、要平整橡胶块，可以用刀片切割模具表面的多馀部分。(1)可重复使用的模具：打开模具，然后将胶带移动到快门的大头部分，进入相应的screw-cap管。(2)一次性模具：剥下模具下的胶带，用小铲子将橡胶块戳入相应的screw-cap管，将模具、胶带、铲子放入废料容器。5、确保砌块低于液面，而不是管道壁。6.把管子放在54 的水箱中孵化2小时，旋转速度约为170转/分钟。7、将纯净水和TE(缓冲液tris-HCl和EDTA)放入50的水箱中预热。第三，橡胶块(为什么要反复冲洗橡胶块？)，以获取详细信息1、从水箱外壳中取出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap (bole company)。平滑倒带CLB。实验台上轻拍管子底部，把橡皮块掉在管子底部。注意：把管子翻转到吸水纸上，尽可能清除管子里的液体。后续工作也是如此。2、在各管中加入15毫升预热后的纯净水。3、确保块位于液体水平以下，而不是管壁或盖子，然后放回50 的水箱水洗器中，摇晃10分钟。4、倒水，用纯净水重新洗。5、倒入水，加入15毫升预热后的TE，在50的水浴摇床中摇晃15分钟。6，击倒TE，以TE重复3次，每10-15分钟。7，将TE倒放10ml TE，放入4冰箱保存备用。注意：确保块位于液体水平以下，而不是管道壁或盖子。四、橡胶块DNA酶切1，在1.5ml eppendorf管道中显示相应的样例和H9812名称。2，按照以下比例，准备缓冲液h稀释剂，拌匀。试剂L/块L /10块纯净水180l1800l缓冲d20l200l总体积200l2000l注：缓冲液必须放在冰上。3、将200l缓冲区h的稀释剂添加到每个1.5ml eppendorf管。4、小心地从TE中取出瓷砖，放在干净的培养皿中。5、用刀片切割2mm宽的橡胶块，然后放入1.5ml eppendorf管。确保块低于液位。将其馀磁带放回原始TE。6、用同样的方法处理标准菌株H9812块。7，将管子放入37的水浴中，培养10-15分钟。8、用稀释缓冲孵化期间，按照以下比例制造酶体缓冲液，均匀混合。试剂L/块L /10块纯净水175l1750l缓冲d20l200l酶(10U/l)5l50l总体积200l2000l注意：(1)将酶放在冰上，使用后立即放入-20 保存。(2)用枪吸缓冲液h，以避免橡胶块损坏。9、在每个管子中加入200l混合物，在实验台上轻拍管子底部，确保橡皮筋在液体水平以下。在10，37水浴中孵化至少2小时。五、添加样品(a)将磁带直接贴在梳子上。1、调整梳子的高度，使梳子接触凹槽的底部。用水平仪调整橡胶罐。那个水平。从2，37 的水浴中取出橡胶块，平衡到室温。3.用枪吸酶切混合液，避免损伤或橡胶块吸收。4，为每个管道添加200l 0.5TBE(Tris硼酸缓冲)。5、把梳子平放在水槽上，将橡胶片加到梳子上。如果你用10个齿的梳子现在，将标准菌株H9812添加到第一、第五、第十个齿中。6、用吸水纸的边缘吸收去除块附近的多余液体，在室温下干燥约3分钟。7、将梳子放在油箱里，确保所有胶水都在一排，有橡胶块和底部互相接触。从插槽底部中心慢慢进入100ml 55 60熔化的1% skg。避免产生泡沫。如果有，就用枪除掉。在室温下凝固30分钟左右。8、记录修正顺序。(b)将块直接添加到附加孔1、调整梳子的高度，使梳子和水槽底部有一定的间距。用水平仪调整胶水使插槽水平。2、把梳子放在水槽里，在100毫升的中心将融化的梳子慢慢倒入55 60天平的1% skg。避免产生泡沫。如果有，就用枪除掉。在室温下凝固30分钟左右。请小心拔梳子。从4，37 的水浴中取出橡胶块，平衡到室温。5.用枪吸酶切混合液，避免损伤或橡胶块吸收。6、每种胶添加200l 0.5TBE平衡。7、用小铲子在样品孔中添加块。8、用溶解胶封闭附加孔。注意：a)可以在水晶洞中添加0.5TBE，利用摩西效果将块沉到水晶洞的底部，防止气泡形成。b)记录校准顺序。六、电泳1、检查电泳槽是否水平。如果不是水平的，请调整凹槽底部的旋钮。注意：请勿触摸触摸电极。(CHEF-DR111)插入2，2.2L 0.5TBE并合上盖子。3、打开主机和泵的开关，并确保泵设置在-70(此时缓冲液的流速约为1L/分钟)缓冲液在管道中正常循环。4、打开凝结水，确保预设温度为14 (缓冲液达到此温度通常需要20分钟)。5、打开水槽的手柄，取出凝固的胶水，用吸水纸去除胶水周边和底部的多余胶水，小心地将胶水放入电泳槽中，关闭盖子。6、设定电泳参数。7、电泳初始电流记录(通常为120-145毫安)。8、电泳终止：终止顺序为凝结水-泵-主机。第二天七、获取图像从包含1，400ml EB溶液的托盘中去除粘合剂(EB存储溶液浓度10mg/ml，1: 10，000稀释，即在400毫升水中添加40l存储溶液)。注意：exabyte是致畸物质。储存在棕色瓶子里的EB稀释液可使用3-5次。废弃的EB溶液必须妥善处理。2、将托盘放在摇动器上摇晃25-30分钟。3、从电泳槽松开TBE，用1-2L纯水清洁电泳槽，倒入液体。4.戴上手套后，小心地倒入用EB溶液标记的棕色瓶子，放在托盘里加入纯净水400-500毫升，放入摇动器脱色60-90分钟，如果可能的话，每20-30分钟换纯净水。5、使用Gel Doc 2000拍摄图像。注：如果是背景干涉分析，则可进一步脱色30-60分钟。6，转换为*.1sc文件以处理分析。八、数据分析读取图像电泳图像通常使用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其他成像系统获取。其他可替代成像设备在具有CCD相机的情况下提供与IBM兼容的未压缩TIFF图像，分辨率768 x 640像素可以使用bio numerics software(applied maths，Inc .)软件与PulseNet数据库中的其他图像进行比较分析。使用GEL DOC 2000的简要说明：QUANTITY ONE软件1、单击QUANTITY ONE按钮打开软件。2、单击“菜单文件”“凝胶doc”。注意：打开窗口需要10-20秒。打开抽屉，把胶水放在桌上。胶水被染成了exabyte或gelstar，完全脱色。用黑色橡胶盒把胶水放在适当的位置。关上抽屉的门。获取图像1、按“埃皮灯光”按钮启用“白光”。2、在捕捉栅格线内部添加粘合剂，使其与捕捉栅格线顶部的蓝色线对齐。3、确保选中栅格线和过饱和按钮。4、调整图像的大(顺时针)小(逆时针)，更改镜头的中间环以使图像占据整个窗口。如有必要，移动主板上的橡胶位置。粘着胶的孔、下边界、左边界和右边界在屏幕上必须可见。5、如果需要，按“BOTTOM RING”调整摄影机的焦距。注：焦距调整有时可用，不能用于每种胶水。可以用尺子调整焦距。6、按EPI-LIGHT关闭白光，按UV按钮打开透射的紫外线。7、单击“自动曝光”查看近似曝光时间。图像出现在窗口中时，AUTO EXPOSE会自动关闭并激活MANUAL EXPOSE。8、单击MANUAL EXPOSE中的按钮以调整曝光时间。调整饱和度时，单击箭头或“TURN THE TOP RING”以减少光线量(图像饱和时图像显示为红色)。注意：如果出现“曝光可能在0.03到360秒之间波动”对话框，则需要更改摄影机的像素以调整饱和度。调整饱和度以确保采样条带没有红色是很重要的。这是因为它会影响BIONUMERICS软件中塑料图像的分析。粘合剂加孔的过度饱和是正常现象。9、如果对图像调整更满意，请按“冻结”按钮停止曝光过程。按UV按钮关闭紫外线(打开门时，如果打开uvlight，则自动关闭)。图像的输出1、保存图像(* .1sc):文件保存。必须选择有效的路径。文件的默认名称为日期、时间和用户。您可以变更档名。2、列印档案：FILEPRINTVIDEO PRINT，或直接按一下萤幕上的PRINT按钮。3，*。转换为TIFF格式：选择FILEEXPORT TO TIFF IMAGEEXPORT以选择正确的路径。4、关闭QUANTITY ONE程序：FILEEXIT。5、去除染色箱中的粘合剂。用柔软的麻布擦桌子表面多余的液体，用70%的水或异丙醇洗净。试剂存储溶液的制备1，1 M TrisHCl，pH 8.0*121.1 g Tris base在650-700 ml纯净水中添加80 ml 6 N HCl*，在室温下将pH降低到8.0，将水的最终体积降低到1000 ml，进行高压杀菌。或157.6 g Tris-HCl溶于800 ml纯净水，室温下pH降低到8.0，倒入水，最终体积为1000 ml，高压杀菌。2，10 N NaOH*400 g NaOH小心地溶于800毫升纯净水，用室温冷却，杀菌的纯净水最终体积达1000毫升。3，0.5 M EDTA，pH 8.0*186.1 g Na2EDTA2H2O溶于800 ml纯水，用50ml 10N NaOH调节pH值至8.0，将水的最终体积除以1000 ml，分为多个部分，高压杀菌。4，20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)*十二烷基硫酸钠-e . coli o 1573360h 7，salmonella and shige llasonnei，pfge小心地将20g SDS放入装有80毫升杀菌纯净水