DNA的复制机理与PCR技术.ppt

第六章（二）DNA的复制机理应用PCR技术,1.DNA的复制,1.DNA的半保留复制2.DNA复制的起点，方向和方式3.DNA复制的过程,1.3DNA的复制,1.3.1DNA复制所需要的酶和因子1.原料：dNTP2.双链DNA模板3.引物4.引物酶5.解旋酶6.单链结合蛋白7.拓扑异构酶8.DNA聚合酶,1.3DNA的复制,1.3.2DNA复制的过程DNA复制的起始DNA复制的延伸DNA复制的终止,Invention1985,KaryB.MullisScienceNobelPriceinChemistry1995,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method,DNA复制原理的应用PCR技术,(一)、PCR技术的基本原理,PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA上的某个特定区段的技术。PCR在人类社会中应用广泛:DNA指纹鉴定，血液中病毒检测等PCR的4种基本要素：ssDNA模板、ssDNA引物、合成DNA的4种原料dNTP、DNA聚合酶。PCR反应的3种基本过程：变性、退火、延伸,SchematicdiagramofPCR,PCR反应动画,PCR反应所用的仪器,PCR仪,(二)、PCR反应所需物质与扩增过程,TaqDNA聚合酶：2499bp嗜热水生菌ThermusaquaticsYT-1菌株。活性：温度半衰期温度合成速率：92.5130分钟72-80150-300个/s9540分钟70约60个/s97.55-10分钟55约22个/s37约1.5个/s22约0.25个/s,Taq酶的活性特点：53方向的聚合酶活性，53方向的外切酶活性，逆转录酶活性，较弱的非模板依赖性，缺乏35方向的外切酶活性。,(2)保真性：,缺乏35方向的校读(proofreading)功能影响因素：Mg2+、pH值、模板DNA是否损伤、dNTP浓度和4种dNTP的平衡。提高保真性的可能途径：掺入少量的具有35方向校对功能的其他耐高温聚合酶，错配率可降为原来的1/10；使4种dNTP的浓度相等，并尽可能保持在不影响DNA合成的最低浓度上；在不影响DNA合成情况下，Mg2+浓度尽可能低，减少高温时间，以减少DNA热损伤；减少循环数；反应体系pH值在70时尽量低于6.0。,2.其他耐热DNA聚合酶：,(1)TthDNA聚合酶：从嗜热真菌ThermusThermophilusHB8中分离而来；在高温和MnCl2条件下，能有效的逆转录RNA，合成cDNA。(2)VentDNA聚合酶：又称TliDNA聚合酶，从Thermococcuslitoralis菌体分离而来，热稳定性极好，97.5时半衰期为130分钟；同时具有35方向的校对功能，扩增忠实性比Taq酶高5-10倍。(3)PfuDNA聚合酶：从PyrococcusFurisus菌株中纯化而来，热稳定性极好，97.5时半衰期大于3小时；同时也具有35方向的校对功能，扩增忠实性比Taq酶高约12倍，最适延伸温度72-78。但是在无dNTP时它会降解模板DNA。,3.PCR引物：,(1)引物设计原则：引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性。引物长度以1530bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。引物的碱基尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在4060之间。,两个引物间不应有互补性，避免形成二聚体。引物自身也不应存在互补序列，避免自身折叠形成发夹结构或本身复性。,(2)PCR引物设计软件,1.GeneRun2.Primer5.0,用户提供碱基序列生物公司合成合成的引物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或高效液相色谱分析(HPLC)加以纯化。引物应该贮存在-20-70。,(3)PCR引物的合成与纯化：,循环次数：,最适循环数：25-35次制备性PCR的循环次数尽量不超过40次，循环次数过多会导致：非特异性产物的增加，dNTP的错配，“平台效应”的产生等。“平台效应”：PCR反应中，当引物、模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶的催化反应将趋于饱和，即PCR反应不再增加。平台效应在PCR反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现之前，PCR产物的数量已经足以满足实验的需要了。,琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段,引物特异性不够强,重新设计引物后,引物二聚体,(三)、PCR反应的类型：,1.锚定PCR（anchoredPCR）：2.不对称PCR（asymmetricPCR）3.反向PCR（InversePCR）4.多重PCR（multiplePCR）5.反转录PCR6.重组PCR7.定量RCR,思考题,1.当你知道一个基因的某个片段的DNA序列时，请设计一个实验把这个基因的全长扩出来？2.如果有一株转基因植物出现了特异性的表型，如何判断是你转进去的基因所导致还是因为你转进去的基因插入某个功能基因的内部而导致？,1.锚定PCR（anchoredPCR）：它是通过在离开已知的小量序列信息一定距离处加上一个确定的序列，这个序列一般为寡核苷酸，然后根据附加核苷酸的序列设计与之互补的序列作为PCR扩增的一个引物，另一个引物来自已知小量序列的核苷酸信息，在两个引物存在下进行PCR扩增（见下图）。由于其中一个引物是与人工接上的附加核苷酸序列互补的，故称为锚定PCR。,锚定PCR的应用：快速扩增cDNA末端：RACE技术(rapidamplificationofcDNAends)(1)扩增已知序列3端区段(2)扩增已知序列5端区段,扩增已知序列3端区段为了产生3端的下游区段，用oligo(dT)作引物，它与poly(A)尾互补，经逆转录合成cDNA第一条链。RNA:cDNA复合物经变性后，用mRNA已知序列设计特异引物1，进行PCR反应，就产生3端cDNA双链。以此双链作模板，以oligo（dT）(17-30)为其中一个引物，特异引物为另一个引物，进行第一轮PCR扩增。由于第一轮扩增产物往往不够，因而还需要对第一轮扩增产物进行第二轮扩增，引物分别是与引物1嵌套的引物2以及oligo(dT)引物。,(2)扩增已知序列5端区段为了扩增5端上游序列，首先从mRNA中的已知短片段序列计特异引物3，与mRNA退火后，用逆转录酶合成cDNA第一条链。使mRNA:cDNA复合物变性，在第一链末端加寡同聚物尾。再与寡同聚物引物退火，Taq酶延伸，得到新合成的cDNA双链。再以此双链为模板进行PCR循环，这样5端上游序列就得到了扩增。,2.不对称PCR（asymmetricPCR）目的：扩增产生特异长度的单链DNA在扩增循环中引入不同浓度的引物，两种引物的浓度比常为50-100：1.在最初1015个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。单链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。,3、反向PCR（InversePCR）：常规PCR可扩增位于二个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA序列，反向PCR则可扩增引物外侧的DNA片段，并对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。,4、多重PCR（multiplePCR）多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常。多重PCR具有灵敏快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southernblotting一样可靠，但多重PCR能检测小片段缺失。,5.反转录PCR：RT-PCR(reversetranscriptionPCR),特点：快速、简便、敏感性极高。目的：检测RNA原理：先在反转录酶作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR扩增。这样，低丰度的mRNA就得以扩增放大，便于检测。,6.重组PCR：,目的：用于基因融合。原理：巧妙地设计和利用寡核苷酸引物，进行初级和次级PCR反应。在初级PCR反应中，每对引物中的一个引物的3端与待重组的基因互补，5端则与另一个待重组基因互补。分别进行PCR，所得的两种PCR产物有部分重