测序基本步骤ppt课件

蛋白质一级结构（primarystructure）的测定,1,蛋白质测序的发展简史自从1953年Sanger首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。但是Sanger花费多年时间才基本搞清胰岛素的一级结构，现在由于方法改进及自动化分析仪器的产生，现在已有数百种蛋白质的氨基酸序列问世。,2,氨基酸序列测定的基本步骤（化学方法）,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端和羧基末端为何种氨基酸把肽链水解成片段测定各肽段的氨基酸排列顺序综合运用多种水解法分析肽段中的氨基酸顺序,3,测序前的准备工作,要求：样品纯度：97%以上相对分子质量：允许误差在10%左右（一）多肽链的拆分几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度的盐处理，即可使寡聚蛋白质中的亚基。如果多肽链间通过共价键（SS）连接在一起，可采用氧化剂或还原剂将其断裂。（二）测定蛋白质分子中多肽链的数目通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。（三）二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防它重新被氧化。,4,一、氨基酸组成,蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数。,5,6,二、末端测定的具体方法,7,二硝基氟苯法(Sanger法）,2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成黄色二硝基苯衍生物（DNP-氨基酸）,8,氨基肽酶法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个地向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-端残疾顺序,9,C-末端之肼解法,多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。肼解过程中，谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等被破坏而不易测出，C-末端的精氨酸转变为鸟氨酸,10,羧肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个地水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-端残疾顺序,11,还原成氨基醇法,多肽C-端氨基酸可被硼氢化锂（LiBH4）还原成-氨基醇，用层析法可以鉴定氨基酸种类。Sanger早期测定胰岛素C-末端氨基酸采用此法。,12,三、水解肽链成肽段,水解后得到的肽段，可用离子层析或其他层析方法将其分离纯化。比如用双向电泳可以得到肽图，由此可知肽段的多少。,13,四、Edman降解法测定肽段的氨基酸序列,耦联：使用苯异硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，即PTC-肽。水解：PTC-肽用三氟乙酸处理，N-端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。,14,萃取：将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。转化：萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸。Edman降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基，所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，然后再进行Edman降解测序。,15,五、鉴定每个肽段氨基酸顺序,ABCDE*ABCDE部分水解*A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE完全水解*A,*A+B,*A+B+C+D+EDNFB*A,*A+*B,*A+*B*+*C+*D+*E,肽段经过分离纯化后，即可进行氨基酸测序。但是获得数据之后，还不能得出整条多肽链的氨基酸排列顺序，因为尚不清楚这些片段在多肽链中的先后次序。一般需要用到多种水解法，并分析出各肽段的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中的氨基酸序列。,16,六、确定肽段在多肽链中的次序,利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,多肽氨基酸序列,重叠法：小片段重叠的原理主要用于一级结构的测定,17,七、确定原多肽链中二硫键的位置,一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质选用该法的好处：该酶的专一性比较低，切点多，生成肽段包括含有二硫键的肽段比较小，对后面的分离、鉴定比较容易；该酶的作用pH在酸性范围，有利于防止二硫键发生交换而造成的麻烦。,18,反向遗传法分析多肽链的氨基酸序列,基本原理：中心法则基本步骤：1、分离编码蛋白质的基因2、测定DNA序列3、排列mRNA出序列4、按照三联密码原则推演氨基酸序列,19,为什么进行蛋白质测序?,基因组测序,为了破译遗传密码.现在密码已破,那进行蛋白质组测序有必要吗?基因研究贯穿了整个20世纪,100多年里,双螺旋结构的提出,中心法则的发现,直至基因组的重大突破,使基因研究达到了前所未有的深度与广度.然而,基因只是信息的携带者,蛋白质才是执行者.基因组计划有其固有的局限性,基因组测序是否正确,要从其表达的蛋白来验证,否则,只是一堆乱码而已.3.5万左右基因中一半以上是理论推断,需要从蛋白质角度确认.而且,从蛋白质研究的自身发展来看,我们无法逃避蛋白质组表达谱分析,只是时间问题而已.以前,对蛋白质的研究是优于基因的,因为PCR,测序自动化使其发展猛.80年代末,HillenKamp发展的激光解析质谱,FemJ设计的电喷雾质谱可以高效,精确的测量生物大分子的质量,并测定部分序列,进而用于数据库的检索.MannM等再此基础上通过建立肽质量指纹图谱与肽序列标签等技术实现了质谱对蛋白质进行大规模准确快速自动化的测序.结构生物学是生命科学领域又一个新的研究热点，飞速发展的蛋白质结构分析技术是研究蛋白质功能的基础。随着蛋白质组时代的来临，许多基因组分析留下的悬而未决的问题，可能通过直接的蛋白质的分离和鉴定而得到解决。,20,蛋白质一级结构的比较可以揭示进化的关系,蛋白质一级结构是由编码它的基因确定的，蛋白质一级结构之间的差别可以反映出进化关系。亲缘关系密