类风湿诊断与抗CCP抗体检测.ppt

类风湿诊断与抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）的检测,anticycliccitrullinatedpeptideantibodyanti-CCPantibody,概述,类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病。由于一方面自身免疫的病理机制决定了这类疾病的疑难和复杂；另一方面由于这类疾病累及多个系统和器官，临床表现较为复杂。所以RA以往在临床上更多的表现为“疑难杂症”。风湿性疾病的现状可以概括为“四多”，累及脏器多；起病首发表现多；误诊误治多；致残多。从而也引发出另外一多“病人花费多”！由于风湿性疾病早期表现不典型，有些疾病有两种或两种以上表现相互重叠；同时，风湿性疾病存在相互转化的情形；所以风湿性疾病的早期诊断有一定的困难。因此，对风湿性疾病患者的随访和定期检查显得尤为重要，这也是验证我们早期的诊断是否正确的必由之路。正确的早期诊断是采取规范化治疗、提高患者的生活质量、改善预后的前提。,美国风湿病学会（ACR）1987分类标准,晨僵;3个或3个以上关节肿胀（软组织）;手关节肿胀（近端指间关节，掌指关节或腕关节）;对称性肿胀（软组织）;皮下结节;血清类风湿因子阳性;骨关节X线片示手或腕关节侵蚀性缺损和（或）关节周围骨质疏松。以上14项必须为医师所见，持续6周或以上，具备上列7项标准中的4项，即可诊断类风湿关节炎。,ACR和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）2009年的RA分类标准和评分系统,类风湿关节炎的早期诊断和早期治疗已成为治疗类风湿关节炎迫切需要，以往的分类标准不能达到早期诊断的目的，分类标准不等于诊断标准。临床工作更需要一个可靠的疾病缓解标准（包括临床缓解与结构进展等问题）。但实际上制定一个早期类风湿关节炎的分类标准很困难，有人提出了炎性关节炎的概念，甚至提出了早期炎性关节炎的概念，正是因为这部分患者炎性关节炎不是全部，而是部分发展为类风湿关节炎，在新的分类标准中如果判断有可能发展为持续炎性关节炎或破坏性关节炎，这类关节炎就被认为是类风湿关节炎。,2009年的RA分类标准和评分系统,必要条件至少一个关节肿痛，并有滑膜炎的证据（临床或超声或磁共振成像）在未分化关节炎中需要排除其他疾病引起的关节炎症状和体征。,其他条件血清学：抗环瓜氨酸肽抗体（CCP）和类风湿因子（RF）;受累关节的种类（小或大关节）和数量;滑膜炎的病程;急性血象反应：红细胞沉降率（ESR）和C-反应蛋白（CRP）。,类风湿关节炎的诊断,诊断第一步满足2项必要条件，并有常规典型放射学RA骨破坏的改变，可明确诊断为类风湿关节炎，,类风湿关节炎的诊断,诊断第二步如没有常规典型放射学类风湿关节炎骨破坏的改变，需要进入以下分类评分系统，请记住以下分值表中的得分。不同的关节受累情况再加上区域辨别条件中的任何项目，评分大于6分提示为确定的类风湿关节炎,ACR和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）2009年的RA分类标准和评分系统,受累关节数分值（05分）1中大关节0210中大关节113小关节2410小关节310至少一个为小关节5血清学抗体检测（03分）RF或抗CCP均阴性0RF或抗CCP至少一项低滴度阳性2RF或抗CCP至少一项高滴度阳性3滑膜炎持续时间（01分）6周06周1急性期反应物（01分）CRP或ESR均正常0CRP或ESR增高16分或以上肯定RA诊断,类风湿关节炎的诊断,诊断第三步树枝计算法，根据关节受累情况：10个关节（至少1个小关节）;410个小关节;13个小关节;210个中大关节;按图2是或否继续分类。树枝计算法用文字描述：如满足受累关节大于10个关节（至少1个小关节）（5分）同时满足血清学阳性（或滑膜炎病程6周，或ESR/CRP升高），评分6分;如满足410个小关节受累（3分）同时需要满足血清学高滴度阳性，或血清学低滴度阳性+滑膜炎病程6周（或+ESR/CRP升高），评分6分;,类风湿关节炎的诊断,如满足13个小关节受累（2分）同时需要满足血清学高滴度阳性+滑膜炎病程6周（或+ESR/CRP升高），或血清学低滴度阳性+滑膜炎病程6周+ESR/CRP升高，评分6分;如满足210个中大关节受累（1分）同时需要满足血清学高滴度阳性+滑膜炎病程6周+ESR/CRP升高，评分6分。所以只要满足以上任何一种情况，即提示为确定的类风湿关节炎。,实验室检查,目前临床上对于RA的疑似患者所采取的初步筛查实验室检测手段多为常规风湿四项，为血沉检测（ESR）、C反映蛋白检测（CRP）、类风湿因子检测（RF）、抗“O”检测（ASO）。ESR和CRP与RA的活动性有关，其检测结果受多因素的影响，故只作为病情活动性的参考指标；ASO是一项排除性指标。这三项检测对于RA疑似患者的早期诊断意义不大。RF是目前最为常用的RA诊断指标，但目前常用的RF检测多为检测IgM型，而IgM-RF在RA诊断中的敏感性只有4070%，特异性只有70%左右，同时尚可见于5%的正常老年人、其它自身免疫性疾病、肝炎、结核等疾病。RF阴性并不能排除RA的诊断，约30%的早期RA患者RF为阴性。所以单纯依靠常规风湿四项检测对于RA作出早期诊断并指导临床治疗还远远不够。,实验室检查,近年来形成了一些敏感性和特异性都非常高的RA诊断技术，如抗环瓜氨酸肽抗体（CCP）检测、抗角蛋白抗体（AKA）检测、抗RA33/RA36抗体检测、抗Sa抗体检测、抗核周因子抗体检测等。以上抗体中两项同时阳性者RA的可能性高达91.3%。其中，抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体检测对早期RA诊断的敏感性和特异性高，是目前最常用的早期诊断指标。,抗CCP抗体的定义：,一种自身抗体。是类风湿性关节炎特异而敏感的早期诊断指标，可鉴别侵蚀性、非侵蚀性类风湿性关节炎，阳性者通常出现或易发展为严重的关节骨质破坏。抗环瓜氨酸肽抗体（CCP）是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，对类风湿性关节炎（RA）具有很好的敏感性和特异性，且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。,研究简史,抗环瓜氨酸肽抗体（CCP）ELISA法是1998年Schellkens等建立起来辅助诊断RA的检测方法，该技术一出现，立即备受关注，现已有商品供应。按照前丝集蛋白cDNA序列，人工合成可能具有抗原表位的919个氨基酸短肽，并经胍氨酸化修饰，经ELISA筛选出具有抗原性片段。,检测方法,现有ELISA法、增强化学发光法、胶体金法目前国内已有许多厂家有商品试剂盒供应。,ELISA检测原理,应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中CCP水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入CCP抗原、生物素化的抗人CCP抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CCP呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。检测范围：3.9ng/ml-250ng/ml,增强化学发光法原理,利用抗原抗体特异性结合及酶底物Luminol发光体系定量检测CCP。1灵敏度：10U/ml2特异性：与1mg/ml的脂蛋白、25mg/ml的球蛋白、0.1mg/ml的血红蛋白、0.1g/ml的透明质酸、2mg/ml的粘蛋白、0.05mg/ml的2-微球蛋白不发生交叉反应。3精密度：批内CV值小于10%、批间CV值小于15%。4线性范围：0160U/ml,胶体金法原理,采用胶体金免疫层析技术，以间接法检测血清中的自身抗体。检测结果：阴性、阳性,标本的采集及保存,1.细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20，且应避免反复冻融。2.血清：标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000 xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。3.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8C1000 xg离心15分钟，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。,ELISA操作注意事项,1.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。2.一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。4.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。5.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。6.底物请避光保存,临床应用,1敏感性和特异性：抗CCP抗体与RF具有相同的敏感性（抗CCP抗体：80，RF：79），但特异性更高（抗CCP抗体：96，RF：63）。2可应用于早期诊断：研究发现抗抗体与早期强相关，在79的早期患者中可检出抗CCP抗体，阳性预测值为84%。3区别RA和其它风湿性疾病：(系统性红斑狼疮)和在早期,有时候都会出现小关节侵蚀性病变,研究发现抗抗体在区别早期和早期侵蚀性小关节病变的时有很重要的价值。4