造血干细胞定向分化扩增与移植.ppt

HSCT,造血干细胞定向分化扩增与移植,追溯干细胞的发现史,1868年，德国生物学家ErnstHaeckel第一次利用“干细胞”一词来描述受精卵（fertilizedeggorzygote）。1981年起，研究人员长期致力于小鼠胚胎干细胞研究工作。1998年，研究人员首次分离出小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell)。2006年，日本首次诱导小鼠胚胎成纤维细胞成为多能干细胞，并命名为iPS（inducedpluripotentstemcell）。2007年11月，美国和日本同时宣布将人体皮肤细胞诱导成了iPS。,干细胞(stemcell,SC)研究,成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域。1999年,2000年连续两年被美国Science杂志评为本年度十大科学成就之一。2001年被列入当今六大热门科技研究领域之一。2008年CellStemCell创刊仅2年,影响因子（impactfactor，IF)从0冲至16.82623.563（2009年）25.943（2010年）。,胚胎干细胞(embryonicstemcell，EC)成体干细胞(somaticstemcell)：,干细胞分类,造血干细胞神经干细胞肌肉干细胞,胚胎干细胞,神经干细胞,光学显微镜下的神经（左）和肌肉（右）干细胞,按发育状态,unipotent（单能）:somaticSC,干细胞分类,按分化潜能,Totipoent(全能):ES,pluripotent（多能）:somaticSC,WherewefindsomaticSC?,muscles,skin,ThereareothertissuesandorganscontainingsomaticSCexceptforabovementioned.,Somaticstemcells:Haematopoieticstemcells(HSCs),诱导性多功能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPS),2006年日本首次通过逆转录病毒将4个转录因子即Oct3/4、Sox2、c-Myc及Klf4导入小鼠胚胎成纤维细胞（mouseembryonicfibroblast，MEF）获得一种多能干细胞，并命名为iPS。2007年11月，美国和日本同时宣布将人体皮肤细胞(skincell)改造成了iPS。,iPS:noneedforembryos!,干细胞的端粒酶（telomerase）,普通细胞受到端粒(telomere)的限制，在经历一定次数的分裂后就会死亡。细胞的DNA复制机器无法达到DNA链的最顶端，因此随着每次细胞分裂端粒会逐渐缩短。而干细胞中包含一种端粒酶，能够构建端粒备份，使细胞获得永生。,干细胞的应用,“制造或再生”器官，为细胞治疗、组织替代治疗、器官移植等提供新的技术途径。与基因工程技术相结合，利用基因定点缺失与突变等进行更加有效的基因治疗，为疾病、创伤、衰老和遗传等因素所致的组织器官损伤或功能障碍的治疗提供了新的思路。解决人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、恶性肿瘤、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病的治疗。,StemCells:Flexiblefriends.Nature2012,Mar1,483:S22S26.DOI:doi:10.1038/483S22a,我国建成世界最大人胚胎干细胞库,我国建成世界最大人胚胎干细胞库,中南大学生殖与干细胞工程研究所所长卢光琇带领科研团队，建成了目前世界上最大的具有不同组织，相容性抗原的人胚胎干细胞库。建立的人胚胎干细胞系已达300多株，使保存的早期微量细胞的复苏效率超过了95%，达到国际领先水平。并建立了世界上首个基因完全纯合的人类孤雌干细胞系。,我国建成世界最大人胚胎干细胞库,替换那些因病“下岗”的细胞修复那些“过劳死”的组织起到“全能修理工”的作用目前,除造血干细胞移植被作为成熟技术应用于临床治疗外，其他干细胞移植技术尚处在临床研究阶段。,干细胞移植,造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口,造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型。造血干祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清楚，可进行定量分析，且可分选。造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因子、受体、信号转导、微环境（niche）等因素较为清楚。造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，便于直接应用于临床。,TheNobelPrize,1990E.DonnallThomas,firstsuccsessfulHSCTintreatmentofacuteleukemiaThomasED,LochteHL,LuWC,FerrebeeJW.Intravenousinfusionofbonemarrowinpatientsreceivingradiationandchemotherapy.N.Engl.J.Med.1957;257:491.,什么是造血干细胞移植？(HeamatopoieticStemCellTransplantation，HSCT),经大剂量放化疗或其他免疫抑制预处理，清除受体体内的肿瘤细胞和异常克隆细胞，阻断发病机制，然后把自体或异体造血干细胞移植给受体，使受体重建正常造血和免疫功能，从而达到治疗目的的一种治疗手段。,一、按细胞来源,造血干细胞移植的分类,骨髓干细胞移植（BMT）外周血造血干细胞移植(PBHSCT)脐带血干细胞移植（UCBSCT)胎肝移植(FLCT),自体（autologous）异体造血干细胞移植异种（xenogeneie）,二、按供体与宿主的关系,同基因（syngeneic）:同卵双生异基因(allogeneic）:有血缘（related）无血缘（un-related),清髓性造血干细胞移植非清髓性造血干细胞移植,三、按供受体间HLA相关性(HumanLeukocyteAntigen),HLA全相合HLA不全相合HLA不相合,四、CD34细胞移植,五、按预处理强度和目的,1骨髓移植（bonemarrowtransplantation，BMT）通过多点骨髓腔穿刺，抽吸含HSC的骨髓血混合液，是经典的移植方法，效果可靠。但采髓需在全麻或硬膜外麻醉下进行，通常需采集骨髓混合液600-1000ml，具体数值随患者体重来定,但GVHD(graftversushostdisease)发生。包括自体BMT（autologousBMT，ABMT）同基因BMT（syngeneicBMT，syn-BMT）异基因BMT（allogeneicBMT，allo-BMT）,2外周血干细胞移植(peripheralbloodstemcelltransplantation,PBSCT)使用药物和细胞因子动员,促使HSC从骨髓释放到外周血，然后通过血细胞分离机从循环血中收集HSC。与BMT相比，具有采集方便、供者不需麻醉、移植后造血细胞恢复快，而GVHD发生率和严重程度并无明显增加等优点。包括自体PBSCT（autologousAPBSCT）异体PBSCT(allogeneicPBSCT,allo-PBSCT),3脐带血干细胞移植(Umbilicalcordbloodstemcelltransplantation，UCBSCT)胎儿脐带血和胎盘中含有大量造血干细胞，且免疫原性不成熟，在同胞兄妹中HLA配型不完全相合者也能植活，不过无关供者脐血干细胞移植仍需要作HLA配型。与BMT及PBSCT相比，脐带血干细胞具有异体排斥反应小，免疫原性低，再生能力和速度是前者的10到20倍，受病毒感染的风险低等特点。,胎儿的脐带结构示意图,脐带血干细胞体外集落图,什么是造血干细胞？HeamatopoieticStemCell，HSC,红色为CD34表型的造血干细胞，绿色为CD31表型的内皮细胞，蓝色为DAPI。,胎盘绒毛膜显微镜图像,祖/定向干C,幼稚C(早中晚),原始C,成熟C,血细胞发生演变规律,分化:强弱无胞体:大小胞核:大小，染色质稀密，核仁有无胞质:少多，嗜碱性由强弱无，特殊产物无少多,HSC,haematopoieticstemcell;CLP,commonlymphoidprogenitor;CMP,commonmyeloidprogenitor.,Schematicviewofadulthaematopoiesis,存在于造血组织中的一类原始的造血细胞自我更新(selfrenewing)多向分化(multipotentdifferentiation)各种血细胞与免疫细胞的起源细胞。能重建造血，同时重建免疫。,造血干细胞（HSC）,第一节造血干/祖细胞的生物学特性,外周血造血干/祖细胞物理特性,正常外周血中HSC含量极少，约为骨髓的1%,比中等大小圆型淋巴样单核细胞略小。在人类尚无检测真正造血干细胞的方法，一般LTC-IC或CFU-BI可代表干细胞的数量。CFU-GEMM代表多能造血祖细胞。外周血造血/祖细胞约占单个核细胞的0.01-0.1%。,CFU:colonyformingunit集落形成单位LTC-IC:long-termcultureinitiatingcell长期培养起始细胞CFU-BI:colony-formingunit-blast原始集落形成单位CFU-GEMM：CFU-granulocyte/erythroid/macrophage/megakaryocyte粒/红/巨噬/巨核集落形成单位,CD34+(最广泛的HSC的表面标志)AC133（细胞表面糖蛋白）c-kit(CD117）+（SCFR,造血干细胞因子受体）Flt3(CD135）+KDR+（Vascularendothelialgrowthfactorreecptor2，VEGFR2)CD38CD33-Thy-1-（CD90low）（胸腺细胞表面抗原标志）CD71HLA-DR（与细胞增殖有关）MCD45RAlowLin(已分化为特定细胞的标记)Rh123lowHO33342low,外周血造血干/祖细胞表型特性,方法：利用各种抗CD抗原的单克隆抗体区分。,外周血造血干/祖细胞功能特性,以体外半固体培养中集落形成能力来测定,CFU:colonyformingunit集落形成单位LTC-IC:long-termcultureinitiatingcell长期培养起始细胞HPP-CFC:highproliferationpotentialcolonyfomingcell高增殖力集落形成单位CFU-MIX:混合集落形成细胞CFU-GM:粒单细胞集落形成细胞CFU-G:粒细胞集落形成细胞CFU-M:巨噬细胞集落形成细胞CFU-E:红细胞爆式集落形成细胞CFU-Meg:巨核细胞系集落形成细胞,早期祖细胞,多向或双向,定向,集落形成的关键是培养体系（细胞因子和血清等）CFU-GM和总CFC常用作评估外周血移植物质量的指标,骨髓象分析,遗传学、免疫学及分子生物学分析,配型,采集HSC,预处理：TBI(totalbodyirradiation）,回到层流病房HSC输注,造血干细胞移殖流程,第二节造血干细胞的动员、采集、处理,造血功能恢复,动员,采集,冻存,预处理,回输,一.外周血造血干/祖细胞动员,动员的机制“造血动员式”化疗化疗动员的具体方案造血因子的使用化疗与造血因子联合,动员剂将造血干细胞动员到外周血。化疗药物:反馈性造血增生。造血细胞因子:刺激造血细胞增殖及向髓外转移。动员前:PBCD34+0.1-0.2%，动员后：1-2%,（一）动员的机制,具体方案大剂量单一化疗药物：CTX(cytoxan,环磷酰胺)-4g-7g/m2VP16(etoposide，依托泊苷)-2g/m2Melphalan（马法兰）-140mg/(m2,d1-2)联合化疗CTX4g/m2,VP16600mg/m2,（二）“造血动员式”化疗,（三）造血因子的使用,GM-CSF：Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor粒巨噬细胞集落刺激因子G-CSF：Granulocytecolony-stimulatingfactor粒巨噬细胞集落刺激因子SCF：stemcellfactor干细胞因子IL-3：interlukin-3白介素-3IL-11：interlukin-11白介素-11IL-8：interlukin-8白介素-8IL-1：interlukin-8白介素-1MIP-1：MacrophageInflammatoryProteins巨噬细胞炎症蛋白1PIXY321：重组人GM-CSF/IL-3融合蛋白,（四）化疗与造血因子联合,化疗及G-CSF的联合动员化疗及GM-CSF的联合动员化疗及其他细胞因子的联合动员IL-3PIXY321SCF,二外周血造血干/祖细胞采集,（一）供者准备患者用化疗药物及造血细胞因子联合动员在白细胞数从最低点回升达到1X109/L时开始采集，有时延误到4X109/L。常规使用ACD-A（acidcitratedexotrosesolutionA,酸性枸橼酸盐葡萄糖溶液）抗凝。,血细胞分离机：全自动、全封闭、连续和不连续、间歇的血细胞分离机。如CS3000plus每天一次，每次10L全血，可连续2-3次,(二)采集冷冻保存：分离外周血单个核细胞,1采集的细胞数,评价移植物是否足够,有核细胞总数：2-6X108/kgCFU检测CD34+细胞数：1-3X106/kg,ACD-A：大量使用时致ACD中毒引起低钙少量。容量不足：通过打断采集程序即不断减少流速来完成。血小板减少症（thrombocytopenia）：由于血小板（platelet）粘附于设备表面引起的，通过回输富含血小板的血浆(plateletrichplasma,PRP)或输血小板来纠正。,2采集并发症,3处理,细胞浓度：5X107/mlpH74保存CFU最好。,4进一步处理,富集CD34+,去除肿瘤细胞，去除T细胞,5冷冻保存,常温液态下储存几天，通常冷冻。加入细胞保护剂DMSO。,6长期储存,在-196液氮中至少5年。在-80机械冰箱储存的时间最长为2.5年。应装置24小时警备系统。避免交叉感染的因素如袋子之间用双腔袋、冷存时液态蒸发等。,四解冻与回输,副反应：DMSO诱导组胺释放。措施：患者要经过水化和用抗组胺药抗休克。目的：减少血管塌陷和低血压。,第三节CD34+细胞的分选,一CD34+细胞的分选的必要性,在体外纯化和富集CD34+细胞。在APBSCT中，净化残留肿瘤细胞而减少复发。在allo-PBSCT中,去除T细胞,减轻GVHD发生。对难治性自身免疫性疾病，可纯化除去异常免疫细胞。可提高干细胞体外扩增及基因转导的效率。,二造血干细胞移植物中肿瘤细胞的污染,基因标记实验证实了一些肿瘤病人，自体移植后绝大数患者检出基因标记的肿瘤细胞。用药物体外净化比未净化的移植复发率低。残留肿瘤细胞再输入是肿瘤复发的重要因素。因此，从自体移植物中清除污染的肿瘤细胞是十分必要的。,低倍镜下肿瘤细胞,免疫净化（immunologicpurging）,定义：在体外用免疫学的方法消除移植物中残留的肿瘤细胞的措施。免疫正净化（immunologicpositivepurging）：将正常造血干细胞从移植物中纯化出来。免疫负净化(immunologicnegativepurging)：将肿瘤细胞从自体移植物中清除。免疫双净化（immunologicdoublepurging）将免疫正、负净化法结合起来。,CD34+细胞正净化的优点,避免细胞毒性药物和免疫毒素对正常HSC的损伤；无需抗肿瘤抗体净化的多环节体外处理，减少污染机会；不会因肿瘤细胞对细胞毒性药物和免疫毒素的敏感性不同而影响净化效应；如联合其它净化方法，可进一步提高净化效应;可减少冷冻保护剂DMSO的使用量，减少其副作用。,三CD34+细胞的分选的原理及方法,原理：CD34+细胞包含在单个核细胞组分中，在分选CD34+细胞前，常用一些非免疫学（如物理或功能）方法去除移植物中的红细胞和成熟粒细胞等成分。密度梯度离心法：它可获得富含单个核细胞的白细胞层，从而初步富集了CD34+细胞。临床上采用血细胞分离机：按一定程序分离出经造血生长因子动员的外周血单个核细胞，这样大大减少了移植物体积，为进一步用免疫学分选CD34+细胞做好准备。,pm，S0，颗粒顺着离心方向沉降p=m，S=0，颗粒达到某一位置后达到平衡pm，S0，颗粒逆着离心方向上浮,离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。,密度梯度离心,Ficoll密速梯度离心法分离外周血单个核细胞（PMBC）,原理：利用密度梯度介质-聚蔗糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液），相对密度1.0770.001。红细胞、粒细胞密度大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。,Systemix公司：高速荧光激活细胞分选系统（highspeedfluoresence-activatedcellsortingsystem），它先用一系列方法去除细胞各系标志阳性的定向祖细胞，然后用流式细胞仪高速分选。,流式细胞仪分离法（FlowCytometry,FCM）-根据细胞表面抗原标志,CD34+,CD34+,将预分选的造血细胞与生物素化（biotinylated）的抗CD34的单克隆抗体一起孵育，然后洗去未结合的抗体，将样本通过抗生物素蛋白包被的聚丙烯酸胺柱的亲和素柱，CD34+细胞滞留在柱内的聚丙烯酸胺球表面上，通过轻轻的机械摇动，冲洗出CD34+细胞。Cellpro公司：Ceprate临床型CD34+细胞分选机,免疫吸附法（ImmunityAbsorption，IA）根据生物素抗亲和素柱分选系统,Anti-CD34+biotinylatedAb,WashunboundAbs,Anti-biotinyaffinitycolumn,Gentleshaking,原理：已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离。,免疫磁珠分离法（magneticactivatedcellsorting,MACS）,四CliniMACS临床细胞分选系统,五自体外周血CD34+细胞移植的临床应用,具有移植后造血和免疫功能恢复快等的特点。有净化污染肿瘤细胞效应高的优点。在治疗不表达CD34抗原的恶性肿瘤临床上广泛应用。包括：非何杰金氏淋巴瘤（NHL）多发性骨髓瘤乳腺癌神经母细胞瘤其它疾病,如自身免疫性疾病,HSCT已成为治疗及治愈如下疾病的最佳选择,恶性血液病,急性髓细胞性白血病急性淋巴细胞白血病慢性粒细胞性白血病毛细胞性白血病恶性组织细胞病,重型再生障碍性贫血重型海洋性贫血骨髓纤维化,恶性肿瘤,骨髓增生异常综合症多发性骨髓瘤非霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤,恶性疾病,非恶性疾病,造血系统疾病,遗传性疾病,先天性免疫缺陷病先天性造血异常症先天性骨骼异常症粘多糖储蓄症粘蛋白脂质代谢病,系统性红斑狼疮多发性硬化症糖尿病放射病AIDS病,自身免疫性疾病,干细胞治疗型糖尿病,采用自体干细胞移植T淋巴系统抑制的方法，可以重建免疫系统和胰腺功能根据国外5年长期随访跟踪结果显示，接受移植后的I型糖尿病病人有90以上停用或减少了胰岛素注射。,六异基因外周血CD34+细胞移植的临床应用,HLA相合的同胞间，减少或减轻GVHD；HLA不全相合（1-3个位点不合），不仅减轻GVHD，且可增加移植细胞量，减少移植物排斥反应；从同一家族供体中输注CD34+细胞，增强骨髓增生低下受体的造血功能；适用于HLA相合无关供受体间的移植；用于将供体CD34+细胞和T淋巴细胞分离后分别先后移植和输注；适用于分选CD34+细胞后体外扩增后的移植和输注；用于体外产生和扩增抗原特异性免疫效应细胞(antigenspecificeffectorcell)和抗原递呈细胞（antigenpresentingcell,APC），以进行细胞治疗。,中国HSCT概况,CSBMT(ChineseSocietyofBMT),中国不同城市的HSCT数量,中国不同单位的HSCT数量,中国HSCT适应症（2009）,MM,Otherleukemia,Autoimmunedisease,Solidtumor,AA,AML：acutemyelogenousleukemia急性髓性白血病ALL：acutelymphoblasticleukemia急性淋巴细胞白血病,MM：MultipleMyeloma，多发性骨髓瘤AA：AplasticAnemia再生障碍性贫血,CML：Chronicmy