低值鱼蛋白多肽-钙螯合物的制备和抗氧化、抗菌活性研究

2 0 2 2 0 0 8 , V o 1 2 9 , N o 0 1 良 品 科 学 生 低值鱼蛋白多肽 一钙螯合物的制备和 抗氧化、抗菌活性研究 杨粢 1 ，邓 尚贵 2 ，秦 小咧 3 ( 1 集美大学生物工程学院，福建 厦门 3 6 1 0 2 1 ； 2 浙江海洋学院食品与药学学院，浙江 舟山 3 1 6 1 0 0 ；3 广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 5 2 4 0 2 5 ) 摘要：探讨了以南海低值鱼蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶和风味酶的复合酶水解制备多肽复合物，并制备多肽 钙螯合物，对螯合工艺及螯合产物的结果及抗氧化和抗菌功能特性进行了初步研究。结果表明：DH为 5 的多肽 与钙离予螯合效果最佳，螯合率为8 1 7 5 ；化学分析及红外光谱说明活性肽与钙离子螯合并形成稳定结构的螯合 物；未经过乙醇沉淀的螯合钙具有明显的抗氧化活性 ，其抗氧化作用相当十生育酚的9 4 4 3 ，经过 8 0 乙醇沉淀 的螯合物具有显著的抗枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌活性，其抑菌圈均直径分别为 1 6 mm和 1 6 mm。通过本研究， 不仅为低值鱼的深精加工与综合利用开辟了新的途径，而且也为低值鱼酶解多肽螯合物的广泛应用奠定了基础。 关键词 ：鱼蛋白；多肽 钙螯合物；酶解制备；抗氧化；抗菌 S t u d y o n S y n t h e s i s o f P e p t i d e s Ca l c i u m Ch e l a t i o n f r o m Lo w v a l u e F i s h a n d An t i o x i d a t i o n andAn t i b a c t e r i a l Ac ti v i ti e s Y ANG S h e n ，DE NG S h a n g g u i ，QI N Xi a o - mi n g ( 1 S c h o o l o f Bi o t e c h n o l o g y ， J i me i Un i v e r s i t y ， Xi a me n 5 2 4 0 2 5 ， C h i n a； 2 C o l l e g e o f F o o d a n d Me d i c i n e ， Z h e j i ang O c e an U n i v e r s i t y ， Z h o u s h an 3 1 6 1 0 0 ， C h i n a； 3 C o l l e g e o f F o o d S c i e n c e and T e c h n o l o g y ， G u ang d o n g O c e an Un i v e r s i t y ， Z h anj i ang 5 2 4 0 2 5 ， C h i n a ) Ab s t r a c t：Th i s s t u d y f o c u s d o n t h e p r e p a r a t i o n o f l o w v a l u e f i s h p r o t e i n c h e l a ti n g Ca 2 b y c o mp o u n d e n z y mo l y s i s me tho d ， an d s tud y o n the a s p e c t s o f c h e l a t e c o n dit i o n ， ant i o x i d a t i o n and a n ti b a c t e r i al f u n c ti o n Th e res u l t s s h o we d tha t the p e p t i d e s o f DH5 h a v e theb e s t c h e l a ti o ne ffe c t wi t hCa 2 +wi t hthep e r c e n t o f c h e l a ti o n 8 1 7 5 Th e c h e l a ti o nbet we e nthe m wa s e x p l a i n ed b y c h e mi s t r y an aly s i s and I R me t h o d Th e r e s u l t s d e mo n s t r a t e d t h a t t h e i r o n c h e l a t e s h a v e s t a b l e s t r u c ture， the d e p o s i t i n the s o l u ti o n o f wa t e r h a s 9 4 p e r c e n t an t i o x i d a t i o n c a p a b i l i t y o f O L - toc o p h e r o l ， the d e p o s i t i n the s o l u ti o n o f 8 0 alc o h o l s h o ws s i g n i fic ant i n h i b i t o r y a c ti v i t y a g a i n s t B a c i l l u s s u b t U i s and S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ， and the anti b a c t e r i al d i a me t e r s a l e 1 6 i n r n a n d 1 6 mm r e s p e c tiv e l y T h e a b o v e r e s e a r c h l a y s a n e w wa y t o u t i l i z e wa s t e r fi s h and p r o v i d e s the e s s e n ti al i n f o r ma t i o n f o r the e n z y ma fi c all y h y d r o l y z e d wa s t e fis h p r o t e i n c h e l a t e K e y wo r d s ：f i s h p r o t e i n； p e p t i d e s - Ca ； c h e l a t i o n ： e n z y mi c p r o c e s s ： a n t i o x i d a t i o n a n ti b a c t e r i a l 中图分类号：T S 2 0 1 2 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 2 6 6 3 0 ( 2 0 0 8 ) 0 1 0 2 0 2 0 5 近年来 ，人类钙 营养 足 的问题 受到 了广泛 的重 视，无论是老人还是儿宽 ，缺钙是全球性的营养 问题 。 我国的膳食组成 以植物性 食物 为主，植酸盐、纤维素 、 糖 醛酸 、藻酸钠 和草酸等含 量较高 ，食物中钙 的吸 收 率很低 。因此 ，除 了寻求 良好的钙补 充制剂外 ，提 高 现有膳食中钙的吸收利用率亦是解 决缺钙 问题 的方法之 一 。而蛋 白质 经水解后得到 的小肽 ，则能增加小肠对 钙 的吸收及其在体 内的蓄积 。这种由磷酸肽诱 导的钙代 谢并 需要 VD t 1 - 2 。 虽然我们 在酶解蛋 白和 离子结合方面有 了较 大发 展，但就水解度( D H) 与离子结合的关系方面的研究在世 界范围内几乎为空 白，且多数研 究还仅局限于陆地 的一 些 动物 蛋 白。 本实验提出以南海低值鱼为原料采用木瓜蛋白酶和 风味酶混合 的复合酶控制水解方法制备 D H小于 2 0的水 解物研究其对钙离子结合活性，并对其产物结构及活性 收稿 日期：2 0 0 6 1 1 1 0 基金项目：国家 自然科学基金资助项 目( 3 0 3 7 1 1 2 3 ) 作者简介：杨桑( 1 9 8 1 ) ，男，助教，硕士，研究方向为水产品加工及食品生物技术。E ma i l ：t h a n k t h a n k c n 1 6 3 c o m 维普资讯 生物工程 艮 晶 斛 学 2 0 0 8 , V o 1 2 9 , N o O 1 2 0 3 进 行 分 析 。 1 材料与方法 1 1 材料 与仪器 1 1 ， 1 材料 南海新鲜小杂鱼 市售；外= 瓜蛋 白酶( 2 0 0万 U g， 固体粉末) 、风味酶( 4 0万 U g ，固体粉末) 广西南宁 庞博生物工程有限公刮 ； 油酸( 1 i n o l e i c a c i d ) 标准 品、 2 一 硫代巴比妥酸( 2 一 t h i o b a r b i t u r i c a c i d T B A ) 标准 品、生 育酚( 0 【 一 t o c o p h e r o 1 ) 标准品 S i g m a 公一 J 。 1 1 2 仪器 雷磁牌 P HS 一 2 5型p H计、雷磁牌 J B一 1 A型磁力搅拌 器 上海精科雷磁仪器厂；飞利浦搅拌器 H R 2 8 3 8 广东 中山五金器具制造厂；光学读数分析天平( T G 一 3 2 8 A ) 上 海伟业仪器厂；离心机( T D5型台式多管架低速离心机) 长沙英泰仪器有限公司；7 2 2 S可见分光光度讣 上海精 密科学仪器有限公一 J ；电热恒温水浴锅( H H S ) 江苏南 通县通海 电器厂； F T S 一 1 7 S C型经傅立叶变换红外光谱仪 美 国Bi o Re d公 。 1 1 - 3 试剂 无水氯化钙( Ca C1 2 ) 、浓 硫酸( H 2 S 0 4 ) 、高锰酸钾 ( KMn O ) 和盐酸均为分析纯。 1 - 2 方法和步骤 1 2 1 合成工艺 脱脂 低值鱼 酶解一测水解度一按比例加入金属一搅 脱脂 拌一调节 p H一震荡合成一离心分离一 9 5 乙醇洗涤一分 级沉淀一抽滤一鼓风干燥一多肽 一 C a 成品 1 2 2 分析方法 1 2 2 1 游离氨基酸含量测定 按照 G B T 5 0 0 9 3 99 6甲醛法标准执行 。 1 2 2 2 游 离念钙含量 的测定 按照 G B 6 2 2 6 8 6 E D T A络合滴定法标准执行 。 1 2 2 - 3 水解度( D H ) 测定 DH ( ) =已水解的肽键数 原料中总肽键数 1 0 0 =【 ( BC) ( AC ) 】 1 0 0 式中，A为原料 中总氨基氮数 ；B为水解液中的氨 摹氮数 ；c 为原料游 离 的氨 基氮数 。 1 2 2 - 4 螯合率 的测定 螯合 率测 定公 式 ： 1 2 2 5 红外光谱测定方法 酶解液经冷冻 T燥后 ，得到肽粉 。而 螯合物产 品 绎酒精分级沉淀可得到 4种螯合产物 ，将它们提纯后， 除去样品中的游离水或结晶水，取固体样 品 2 mg放入玛 瑙研钵中，放入T燥 的光谱纯 KBr 2 0 0 mg，混合研磨均 匀( 在红外灯下进行) ，使其粒度在 2 5 u m 以下，装入爪 片模具 ，抽气加压 ，压力约为 6 0 MP a ，维持 3 5 mi n， 卸掉压力则可得一透 明的 K B r 样品片，利用 岛津 I R 一 4 3 5 红外 分光光度计 进行 定性分析 ，得到光谱 。 1 2 2 6 抗氧化测定方法 硫代 巴比妥酸法 。 具体方法：将 0 2 m l 油酸的样品加入 3 0 m l 试管中， 然后加入 1 0 m l 9 9 5 乙醇和 1 0 m l 5 0 m o l L磷酸盐缓冲液 ( p H 7 0 ) 。每_ 种样 品( 5 0 mg ) 加入到此混合溶液中，然后 用蒸馏水定容至 2 5 ml 。将其放入到培养箱 中在 4 0 C 培养 7 d。TBA溶液根据 Oh k a wa等 的方法配制。该溶液含 有 0 8 m l 水分、0 2 m l 8 1 S D S和 1 5 m l 2 0 的醋酸，然 后用 1 0 mo l L的 Na OH和 1 5 ml 0 8 T BA调 p H至 3 5 。 将 5 0 u 1 的氧化性的亚油酸溶液加入到混合液中，并在 5 培养 1 h ，然后在 1 0 0 加热 1 h 。红色素 的浓度在 波长 5 3 5 n m下测 定其吸光度。结果被表示为对 油酸的 氧 化抑制率 ，同 0 【 生育酚 的抗 氧化性作对照 比较 。 抑 制率 的计算 公式 ： A B 抑制率( ) = 1 0 0 A C 式中，A 为加 5 0 u 1 去离予水、0 2 ml 亚油酸的吸 光度 ；B为加 5 0 mg样品、0 2 ml 亚油酸的吸光度；C为 加 5 0 u 1 0 【 一 生育酚 、0 2 ml 亚油酸的吸光度 。 1 2 2 7 抗菌能力测 定方法 牛津杯双层半板法。 牛津杯双层平板法检测平板的制备 ：在无菌平皿中 倒入 1 0 ml 加热融化的 2 琼脂 ，待其充分冷却凝 固后， 放 入 已灭菌 的牛津 杯数个 ，并按一 定次序 排放 整齐 。 将分装于大试管中的 1 5 ml 固体检测培养基融化后冷却全 5 0 左右 ，加入 1 0 g 个 ml 指示菌液 1 ml ，迅速混合均 匀 ，倒入半 皿 。冷却 后 ，用无 菌镊子取 出牛津 杯 ，作 为活性肽螯合物活性检测平板。用 0 1 m l 吸管吸取 1 O 0 2 0 0 u 1 待测样品 ，以无菌操作加入到检测平板圆孔 内， 3 7 培养 1 5 h ，观察并测定抑菌 圈直径( mm) 。 2 结果与分析 微量元素含量一 游离离子含量 螫合率( ) = 一 O 0 响 ， 脂肪对水解度 的影响 脂肪对 复合酶水解 蛋 白的水解速 率存在着 一定影 分别对脱脂( 脂 肪含量 0 6 2 ) 和不脱 脂( 脂肪含量 维普资讯 2 0 4 2 0 0 8 , V o L 2 9 , N o 0 1 食 品 科 学 生物工程 4 2 8 ) 两种情况讨论脂肪对水解度 的影响。此反应条件 为木瓜蛋 白酶和风味酶添加量为 0 1 ，温度 2 5 ，p H 为 6 5，结果如 图 1、2。 营 0 甘 2 = 高 时间( h ) 图1 水解时间与 D H关系曲线 ( 脱脂) F i g 1 R e la t io n s h i p o f h y d r o l y z e d t i me v s DH( d e f a t t e d ) 吾 0 甘 2 = 昌 时间( h ) 图2 水解时间与 D H关系曲线 ( 未脱脂) F i g 2 R e l a t i o n s h ip o f h y d r o l y z e d t i me v s DH( f a t t y ) 从图 1 、2可 以看 出未脱去脂肪的鱼 肉蛋白在复合 酶的条件下 ，水解度 随时间的变化增 加较快 ，因此不 脱去脂肪更有利于得到 DH小于 2 0的活性肽产物 。 2 _ 2 螯合条件的优化 2 2 1 反应温度对螯合反应的影响 选取 p H为 7 ，时问为 1 5 m i n不变，分别在 1 0 、2 0 、 3 0 、4 0 下进行螯合反应的比较实验 ，产品得率基本相 同，非脱脂鱼 肉蛋 白酶解螯合率为 8 1 左右，脱脂 鱼 肉蛋 白酶解螯合 率为 7 9 左右，说明反应温度对络合反 应 影响不大，故 以室温为宣 ，与文献 5 】 报道 致。 2 2 2 反应时间对螯合反应 的影响 选取 p H为 7 ，温度为室温，分别在 1 5 、3 0 、6 0 m i n 进行 对 比实验 ，产 品得率基本 相 同，非脱 脂鱼 肉蛋 白 酶解螯合率为 8 1 左右，脱脂 鱼 肉蛋 白酶解螯合率 为 7 9 左右 ，说明螯合反应为快速反应 ，反应 时间影响 不大 ，与文献 5 】 报道 致 ，故 以反应 1 5 rai n为宣 。 2 2 3 水解度对螯合反应 的影响 不同水解度 的活性肽产物 ，其平均肽链长度和配体 摩尔数对存在着较大差异 ，平均肽链长度 关系到钙离子 能否顺利通过小肠粘膜 ，而配体摩尔 比是 影响金属离子 与多肽螯合反应 的一个重要因素 ，如果配位 比太小，生 成 的螯合物 不稳定 ；反之 ，若配位 比太高 ，便会造 成 多肽利用率下降。选取 D H为 5 、1 0 、1 5 和 2 0 ， 温度 为室温 ，时间为 1 5 mi n ，p H 为 7研究水解度对 螫 合率 的影响程度 ，实验 结果见 图 3。 擗 吐 濑 樯 匿 躲 5 l O l 5 2 O DH 图 3 水解度对钙离子螯合率的影响 Fig 3 Eff e c t s o f DH o n c h ela t ion p e r c e n t o f Ca 图 3表明，在 同等条件下 DH为 5 时 ，钙离子螯 合率最高 ，而当 DH 为 1 0 、1 5 、2 0 时脱脂 的多 肽螯合率要 比未脱 脂 的螯合率高 。 2 2 4 不 同p H值对螯合反应的影响 p H条件是影响多肽螯合微量元素形成螯合物的重要 因素。在 p H较低的酸性条件下，H+ 将与金属离子竞争 供 电子基 团， 利于多肽微 量元素螯合物 的生成 ；在 p H较高 的碱性条件下 ，羟基与供 电子基团争夺金属离 子而形成氢氧化物沉淀 。选取 p H 4 8范围，在温度为 室温 ，时间为 1 5 mi n ，研究其对螯合反应 的影响程度 ， 结 果见 图 4、5。 术 褂 寸 口 濑 口 DH5 盈 DH1 O DH1 5 DH撕 4 5 6 7 8 p H 图4 p H对钙离子螯合率的影响 ( 未脱脂) F ig 4 E ff e c t s o f p H o n c h e la t i o n p e r c e n t o f C a ( f a t t y ) 由图 4 、5可 以看 出，在一定 p H 范 围 内，随 p H 维普资讯 生物工程 良 品 科 学 2 0 0 &V o L 2 9 , N o 0 1 2 0 5 8 5 8 0 7 5 7 0 6 5 6 0 5 5 5 0 4 5 4 0 口 DH5 囵 DH1 O 圈 DH1 5 口 DH 4 5 6 7 8 p H 图5 p H对钙离子螯合率的影响( 脱H H ) F i g 5 E ff e c t s o f p H o n c h e l a t i o n p e r c e n t o f Ca “( d e f a t t e d ) 值 升高螫合率提 高，这是 由于随着 p H 值升高 ，一 NH z 和 一 C OO H配位能力增强。当 p H 7时螯合率 降低 ，说 明溶液中丌始有沉淀生成 ， 利于得到 多肽钙螯合物 ， 故螯合物 的 p H值席选择 7左右 。 2 3 多肽及多肽 C a 红外光谱分析 1 o 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 波数( c m ) 图6 活-性肽粉的红外光谱分析 Fig 6 I R s p ec t r a o f p e p t i d e s 3 5 0 0 3 0 0 0 2 5 o 0 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 波数( c m ) 图7 三种螯合样品的红外光谱分析 F i g 7 I R s p ec t r a o f f o ur k in ds o f p ep t i d e s c h e l a t i n g Ca 图 7中分别代表鱼 肉酶解蛋 白与钙离子螯合 的产物，其 中样品为螯合反应后 溶于水 的物质； 样 品为螯合反应后加 5 0 无水 乙醇分级沉淀得到 的物 质；样品为螯合反应加 8 0 无水乙醇分级沉淀得到的 物 质 。 从 图 6 和 7中对 比可以看出，活性肽与其螯合物吸 收峰相 比，在 强弱和位 置上有 明显 的变化 ，样 品 在 3 1 3 0 3 0 3 0 c m一 1 铵峰消失，而在 1 1 0 0 c m一 1 左右出 现 了( P t NH 2 ) 吸收峰 ，证 明C a 与 NH z 有结合；羧基离 子反对称振动( Y a S C O O ) 于 1 6 5 0 c mI 1 附近 ，羧基离子的 对称振动( Y S C O O ) 于 1 4 0 0 c mI 1 附近 ，这两处均有较强吸 收峰，证 明Ca 2 + 与 C OO 有 较强结合 。反对称振动( Y a S C O O ) 是判断 C OO M 键共价程度的量度，而反对称振 动与对称振动 的差值 Y D ( Y 一 y , o o o - ) 是羧基离子与 金属 离子 配位方 式 的有 力判 据【 引。样 品 u均在 2 5 0 c m一 1 左右 ，样品13 = 2 3 6 c m一 1 ，推测钙离子与羧 基是 以单齿共价键 的方式结合 。 样品的钙含量分别为 1 6 5 8 、9 7 2 、7 6 8 可 以看 出螯合物随着水溶和醇溶能力增加钙含量减少 ， 螯 合 能力减 弱 。 2 4 多肽螯合钙抗氧化作用研究 采用 T B A法 ，即硫代 巴比妥酸法 。亚油酸是 种 多 不饱和 脂肪 酸 ，是机 体组织和 细胞 的组 成成分 ，为 人体最重要的必需脂肪酸 。评价抗氧化剂的抗氧化能力 大小有多种方法 ，其中硫代 巴比妥酸( T B A ) 染料法为应 用较广的方法之一。T B A法是基于不饱和脂肪酸通过 自 由基反应 ，形成 过氧化 自由基 ，而氧 化生成环氧化物 ， 后者分解生成丙二醛 ，丙二醛与T B A作用生成 T B A染 料 ，最大吸收波长为 5 3 5 n m。多肽螯合钙的抗氧化作用 如 图 8所 示 。 譬 鑫 妞 嚣 口酶解活性蛋白 口螯合物样品 圈 VE 活性肽 V E 样 品 图 8 钙离子螯合物抗氧化活性 Fig 8 An t i o xida t i v e a c t iv i t i e s o f pe p t ide s c he l a t i n g Ca 上图中分别代表鱼肉酶解蛋白与钙离子螯合 经无水 乙醇分级沉淀的产物 ，由图看出钙螯合物都具有 一 定的抗氧化作用 ，其中样品 1 即螯合反应后 未经过无 水乙醇分级沉淀得到 的物质抗氧化作用最强 ，其抗氧化 效果达到生育酚 的 9 4 4 3 。 2 5 多肽螯合钙抗菌作用初探 通过牛滓杯双层平板法，将活性肽及 3 种钙螯合 的 鲫 加 O 加 舳 加 O l l 辟氓 维普资讯 2 0 6 2 0 o 8 , V o 1 2 9 , N o 0 1 良 晶 科 学 样 品对 大肠 杆菌 ，枯草 芽孢杆 菌 ，金黄色 葡萄 球菌 ， 沙门氏菌进行实验 ，实验发现样 品 3即螯合 反麻加 8 0 无水 乙醇分级沉淀得到 的物质对枯草芽孢杆菌和金黄色 葡萄球菌有 较好 的抗菌 效果 ，见 图 9 、 1 0。 图9 活性肽对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果 F i g9 An t iba c t er i a l e ff ec t s ag a i n s t Ba c i l lus s u bt i l i s a n d St a ph y l o c oc c u s au r e u s o f p e p t i d e s 图 1 o 8 0 乙醇沉淀的螯合物对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的 抑菌效果 Fi g 1 0 An t i b a c t er i a l eff e c t s a ga i n s t Bac il l us s u bt i l is a n d St a ph y l oc oc c u s au r e u s of de po s it in s ol u t i o n o f 8 0 al c oho I 合 ，改变细胞 质膜通透性 ，造成膜结构 破坏 ，引起膜 内水溶性物质大量渗 出，从而 导致细菌死亡 7 _ 引 。 3 结 论 多肽螯合钙离子最佳工艺条件为，D H 5 ，p H 7 ， 温度为室温 ，螯合 l 5 mi n ，螯合率可达 8 1 7 5 。螯合 产 品红外光谱分析与螯合前有明显变化，且螯合物 随着 水溶和 醇溶 能力增加钙含量减少 ，螯合 能力减 弱 。此 外 ，在 螯合产物 抗氧化实验 中发现 ，均有 理想 的抗氧 化效果，其中l 号样品即螯合反应后未经过乙醇分级沉 淀得到的物质可达到生育酚的 9 4 4 3 ，同时在抗菌实验 中发现 ，3 号样品即螯合反应加 8 0 无水乙醇分级沉淀 得到的物质对枯草芽孢杆菌 ，金黄色葡萄球菌均有较好 的抗菌 效果 。因此 ，不仅为低值 鱼的深精加工 与综 合 利用开辟 了新的途径，而且也为低值鱼酶解多肽螯合物 的广泛应 用奠定 了基 础。 参考文献 牛津杯孔直径为 8 m m，从图9中可看出活性肽样品 并没有抑菌圈出现，从 图 1 0中可看出样品 3 有较好的抑 f 4 菌效果，其抑菌圈直径为 1 6 mm。而在对 大肠杆菌和沙 门氏菌 的抑菌实验中发现 ，活性肽及其螯合物抑菌作用 均不 明显 ，活性肽样 品无抑菌 圈出现 ，螯 合物抑菌 圈 直径分别为 9 ra m和 1 l mm。 J 目 前对螯合物抗菌的作用机理尚无定论， 部分研究 表 明，螯 合物 的肽 分子可能和细 菌细胞膜 受体蛋 白结 M YKKANEN H M ， W AS S ERM