高效液相色谱.ppt

高效液相色谱(HPLC),第五章,色谱概述HPLC简介HPLC的分类HPLC仪和图形分析,什么是色谱?,色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法常见的分离方法蒸馏离心电泳过滤色谱(目前最有效的分离方法),色谱法简介,色谱法(Chromatography)溯源100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法),色谱法的发展,色谱法是一种现代的分离方法1906年正式命名20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代,色谱法原理,色谱法的原理是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),有一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),流动相又叫洗脱剂,溶剂相(Phase):物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面,色谱法原理,分离是一个物理过程。,固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction),色谱法的分类,按分离过程的机理分:吸附色谱(AbsorptionChromatography)根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离分配色谱(PartitionChromatography)分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同离子交换色谱(IonExchangeChromatography)根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)GPC(GelPermeationChromatography)固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂GFC(GelFiltrationChromatography)固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液,色谱法的分类,按流动相的物态分:气相色谱(GasChromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(LiquidChromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)按固定相的形态分:平面色谱纸色谱薄层色谱柱色谱,色谱法分类示意图,HPLC的产生HPLC的固定相HPLC的流动相,HPLC的产生,液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。,高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC).又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。,高效液相色谱法HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间。,高效液相色谱的固定相,高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.01081.0109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。,固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。1.表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。,2.全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。,液相色谱的流动相mobilephasesofLC,1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)。,4.流动相的要求,由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。,（3）高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。（4）化学稳定性好（5）低粘度（粘度适中）若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。,色谱法按分离机制的不同分为：液固吸附色谱法液液分配色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法亲和色谱法,液-固色谱法(吸附色谱),液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。,吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。,液固色谱法的固定相,液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。,在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广则使用梯度洗脱。,液固色谱法的流动相,在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的差速迁移，从而实现分离。分配系数（K）或分配比（k）小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。,液液色谱,液液色谱法的固定相,液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为3040m的实心玻璃球和厚度约为12m的多孔性外层所组成。（2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径30-50m的多孔型颗粒。（3）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为510m。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。,由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。如，氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。,液液色谱法的固定液,液液色谱法的流动相,在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端，例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。,液液色谱的分类,以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为正相分配色谱，适合于分离极性化合物；反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为反相分配色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。,离子交换色谱ion-exchangechromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成。其中，二乙烯苯起到交联和加牢整个结构的作用，其含量决定了树脂交联度的大小。交联度一般控制在4-16%范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离子基团。,离子交换色谱法的固定相,离子交换色谱法的流动相,离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。,排阻色谱size-exclusionchromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,亲和色谱,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,HPLC仪及各部件HPLC结果分析,液相色谱仪器（1）highperformanceliquidchromatograph,液相色谱仪（2）,液相色谱仪（3）,液相色谱仪（4）,二、高效液相色谱法的特点,特点：高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,三、流程及主要部件,1.流程,2.主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150350105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,(2)梯度淋洗装置,外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,(4)液相色谱检测器,a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm10mm，容积8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,b.光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,光电二极管阵列检测器,c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）,除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,示差折光检测器,d.荧光检测器（fluorescencedetector）,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,(5)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16mm，柱长540cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,有人形容，柱是HPLC的心脏，可见在HPLC工作中选择柱的重要性。因为用不同的柱，因其分离机理也不同，得到的效果也不同。通常有：反相HPLC，疏水HPLC，凝胶过滤HPLC，各种离子交换HPLC，亲和HPLC等等。,对色谱工作者来讲，柱效是不离口的。新柱到货后，厂方都应有检查柱效的结果报告附上。用户可以据此检查验收，但由于试剂、水质、仪器型号等方面的差异和运输过程的影响，按常规，柱效允许有10的差别。,柱的分辨力和柱效的测定，一般采用几种化合物为标淮，在特定的条件下进行分离，并据此结果计算柱效。,一、柱效的测定,以Beckman公司的反相柱为例，采用一些小分子化合物，配置如下：Acetophenone(苯乙酮）33mg，Nitrobenzene（硝基苯）59mg，Benzene（苯）2g，To1uene（甲苯）3g，溶于3L甲醇中备用,进样5ul，254nm检测。,在鉴定Phenyl5PW柱时用丙酮为标准品，水作流动相;在鉴定CAA-HIC柱时用-胰蛋白酶原为标准品(5mgm1，进样5u1)，3.0M(NH4)2SO4,0.5MNH4Ac(pH6.0)和0.5MNH4Ac(pH6.0)，20min内线性梯度洗脱；,在鉴定DEAE-和CM-柱时，分别用Uricacid(0.1mgm1)和Tryptamine(0.1mgml作标准品；在鉴定G2000SW或G3000SW时分别用Dextran(MW500000)，PEG(MW7500)和PEG(MW3000)或已知分子量的蛋白质为标准。此外还有Cyano-，IP-，Si-等柱，都可在厂商的资料中查阅到有关信息。,以应用生命系统(appliedbiosystems)的微柱为代表，直接采用一些标准蛋白质来鉴定反相柱、离子交换拄、疏水柱的分离效果，这对生物化学工作者来讲，更加直观。这5种蛋白质依次是：细胞色素C、胰岛素、乳白蛋白、碳酸酐酶、卵白蛋白。有时也用核糖核酸酶，溶菌酶，胰凝乳蛋白酶原等。-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液(多肽)也用作鉴定柱效。,二、柱的新进展,1微柱(narrowcolumnmicrocolumn)经典的柱是250mm4.6mmI.D,离子交换柱是75mm7.5mmI.D,而微柱内径是12mm，长度有30，100，150等等。微柱的优点是：分辨力至少和经典柱一样，长些的柱效果更好。回收率高。因为柱的载体少，非专一性吸附少。灵敏度高。由于流速仅50200ul分钟(经典柱1m1分钟)，样品的峰尖窄,所以检出灵敏度增加。溶剂消耗少，节省运转费用：以流速100ulmin，一个流程1小时计算，分析一个样品只需6m1洗脱液约仅消耗3m1乙腈。,2无孔径载体柱(non-porousresincolumn),这种载体颗粒度约35um，表面无孔径，因此被分析的物质不会进入载体内部，而只在载体表面进行吸附、疏水结合或交换等，故可用于蛋白质和多肽的快速分析，一般流速1.5m1min只需几分钟即可完成。当应用经典的柱分离生物大分子时，通常使用较慢的流速，因为大分子进出柱介质孔径结构的速度较馒，如果为缩短时间而采用较快的流速，则分辨率下降。无孔径载体柱的发展克服了因蛋白质大分子进入载体颗粒内部而引起的局限性，解决了高流速时样品峰太宽及拖尾等问题。,灌注色谱(perfusionchromatography),它的载体颗粒结构中含有两类孔径，大的孔径有60008000A孔径，它比常规的HPLC柱载体的分离速度快10倍，而不降低分辨力,是大量制备蛋白质类产品很有潜力的方法。,4毛细管HPLC,从1986年发展了微柱HPLC分离蛋白质和多肽，将HPLC流动相流速从经典柱(250mm4.6mmI.D)的1mL/min降低到50u1/min(用两个10m1的注射泵产生梯度，这类泵的优点是没有脉冲，产生的梯度平稳)，1995年K.Yamada发展了毛细管HPLC，用2.5m1的注射泵，流速仅5u1/min，样品上样量525u1；柱为150mm0.5mmI.D；梯度时变化小于10n1/min。,收集系统改为毛细管直接点涂在PVDF膜上，极其方便地定位峰和收集样品(图5-5)。如此收集在膜上的样品，可用刀片割成12mm，然后放在蛋白质序列仪的反应器上进行序列分析，Hsi等用在t-PA工作中，分析量在300fmol10pmol之间。,实际上，近年来已有十多家厂商生产毛细管柱,一般内径是0.32mm，长度150250mm，颗粒度35um，品种有正相，反相有C1(SAS)，C4(Butyl-)，C8(MOS)，C18(ODS)等。图5-6是肽谱分析图。,从经典的柱(内径4.6mm)到微柱(内径约l2mm)，再从微柱到毛细管柱(内径0.5mm)。一般讲，内径小了一半，灵敏度可提高4倍(如从经典柱到微柱)，因此，毛细管HPLC的灵敏度比经典柱有了很大的提高。此外，由于用小内径的柱，流速也相应减小，又使灵敏度有进一步的增加。,HPLC纯化条件,HPLC梯度设置表(例),HPLC的图形结果,色谱图(Chromatogram):色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间,色谱峰,时间(分),基线,峰高,峰宽,响应值,第十次课,液相色谱图名词术语(1),色谱图名词术语:色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号峰底(PeakBase):峰的起点与终点之间连接的直线峰高(PeakHeight