实验十二 血清肌酸激酶测定与应用PPT课件

.1，实验12血清肌酸激酶的测定及应用。2，1实验目的，了解血清肌酸磷酸激酶的测定方法。掌握决定的应用和重要性。3，2实验原理，肌酸激酶(CK)广泛用于骨骼肌、心肌和脑组织，肝脏和红细胞等不包含这种酶。骨骼肌内含量最丰富，占全身的96%。肌酸磷酸激酶在肌肉收缩中很重要，催化以下反应。4，上述反应确保肌肉收缩时能量供应和运动后ATP和肌酸磷酸的再合成。在正常人的血清中，肌酸磷酸激酶主要是骨骼肌和心肌细胞通过细胞膜进入血液，几乎没有其活力。正常值在每升100活力单位以下。运动训练可以增加血清肌酸的磷酸盐活性。据分析，运动中缺氧，代谢产物积累，供体相对不足，肌细胞膜通透性提高。或者肌肉细胞膜受损，使CK从细胞内释放进入血液循环，其中拉向肌肉的机械损伤或血肿生成等是最重要的。5，滑雪和马拉松赛后，血清CK的活性高，特别是高强度马拉松跑得最多。运动后上升4小时，达到8-16小时的最高值。如果在跳跃、短跑等短时间内进行剧烈运动，冲击性运动也容易增加CK活动。运动量大的训练和100米、200米赛跑后，血清内CK活性均显着提高。尤其是在比赛的时候。使用肌酸磷酸激酶进行功能评价时，一般认为2-3天取一次血，负载后在100-200国际活力单位/L。超过200 iu/l的话，运动量太大，如果身体还没有恢复的话，就要调节动量。6，3实验设备和试剂；设备，设备试管，分光光度计，分析天平，采血设备(注射器)，水浴箱，离心机，7，试剂，试剂混合底物pH7.4三甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液：Tris(Tris)2.4g，将蒸馏水添加到100毫升，添加0.2N盐酸88.8ml和无水硫酸镁0.34g，将pH调节到7.4。这种液体在室温下可以保存几个月。0.012米磷酸肌酸溶液：磷酸肌酸(C4H8O5-O4PNa36H2O)436mg，蒸馏水为100ml，将PH调节为7.4，存放在-25 或普通冰箱上部冰箱中，据说可以使用1个月左右。0.001MADP溶液：ADP钠盐0.233g，蒸馏水为100ml，PH调节为7.4，保存在-25或冰箱上部冰箱中，据说可以使用一个月左右。8，在临时使用前，将上述(1)(2)(3)试剂混合10毫升。在这种混合底物液30毫升中，添加盐酸半胱氨酸0.105g，将PH调整为7.4。这种试剂最好新鲜准备，也可以储存在冰箱里。一般可以放5-7天，空旅游密度太大，就产生了自由肌酸，不能再使用了。0.3N氢氧化钡溶液添加氢氧化钡(Ba(OH)28H2O)4.73g，溶解(加热辅助溶解)，稀释为100ml。5%的硫酸锌溶液用蒸馏水溶解硫酸锌(ZnSO47H2O)8.82g，稀释为100毫升。上述2，3两种溶液均配制后，要摄取5%硫酸锌溶液5毫升，放入50毫升三角烧瓶中，添加2滴酚酞指示剂，以0.3NBa(OH)2溶液进行滴定，直到粉红色在30秒内不褪色。Ba(OH)2与ZnSO4相同，如果不相等，可以稀释较厚的溶液。9，标准肌酸溶液(1.7M/ml)准确地取22.3毫克无水肌酸，放入100毫升容量的瓶子，放入蒸馏水溶解，用刻度稀释，放入冰箱，可以使用几天。先用1%的溶液将冰箱放在棕色瓶子里保管。用量大的时候用蒸馏水稀释20倍。存储的碱溶液用蒸馏水溶解30gNaOH，无水碳酸钠(Na2CO3)64g，稀释至500毫升，室温低时可析出，此时应在37 的水中沉淀溶解。 -萘酚溶液取-萘酚1g，用上述储存碱液溶解，稀释为100毫升。这种溶液要做成新鲜的。否则，空旅游密度读数也会提高。10，4实验方法和步骤；肌酸磷酸激酶显色法，肌酸磷酸激酶显色法。确定CK活性原理：利用上述反应产生的肌酸和-萘酚和二乙酸的反应生成红色化合物。在一定范围内，红色阴影与肌酸含量成正比，得到处理相同的肌酸标准液比色的酶活性。确定操作步骤(下表3-14):表3-14单位：ml，13，计算：14，肌酸磷酸激酶检测试剂盒方法：原则ATP葡萄糖-6-磷酸ADP是作用酶葡萄糖-6-磷酸NADP 6-磷酸-葡萄糖NADPH是作用酶，15，设备和试剂：试管，可见光分光光度计，电子分析天平，采血器(注射器)，水浴，离心机，工具包确定方法。例如：中生北控制生命技术股份有限公司生产的肌酸磷酸激酶检测工具包，适用于全自动、半自动生化分析仪和分光光度法测定人血清中CK的酶活性浓度。基本参数：波长：340纳米，温度：25，30，37，有色杯光直径：1厘米。原试剂混合2-8菲光保存，有效期12个月。在2-8 稳定7天，在15-25 稳定12小时。工具包的主要成分和浓度参考表3-15:表3-15肌酸激酶检测工具包的成分和浓度，均匀搅拌372分钟，读取初始吸光度，然后正确的1分钟、2分钟、3分钟分别读取吸光度，确定每分钟的平均吸光度变化 a。表3-16应用肌酸磷酸激酶检测工具包，工作步骤：利用一定量的R2(见R1瓶签名)服用R1瓶，溶解后成为工作液体。工作流体会提前绝热到测试温度。计算：CK(U/L)=(A样例/分钟-A空格/分钟)FF=(Vt/Vs消亡系数)1000=8095(37女：24-170U/L线性上限：CK活性可达到1500 u/L(37)注意事项：a/点大于0.0360(F=4127)，0.0190(F试剂空白吸光度大于0.6时不要使用。血清CK不稳定，收集样本后应尽快分析，室温4 到8 12小时后CK活性很快下降。19，5注意事项，5注意事项，红细胞的肌酸磷酸激酶活性很低，所以溶血标本对测定结果没有影响。混合基质的pH要求是正确的。氧化钡和硫酸锌必须以完全相同的量滴定。否则离心后可能发生混浊。特别是钡离子长时间不能被硫酸盐完全去除，发色模糊，不能影响测量结果。磷酸肌酸酶活性单位的定义：在371小时内，1ml血清和基质的作用，1M肌酸作为1磷酸肌酸酶活性单位生成。酶活性过高时，