十三 DNA的生物合成复制PPT课件

.,1,核酸的生物合成,DNA的生物合成RNA的生物合成,.,2,现代生物学已充分证明，核酸是生物遗传的物质基础。除少数RNA病毒外，几乎所有的生物均以DNA为遗传信息的载体。,.,3,1958年，Crick提出了遗传信息的“中心法则”。DNA通过复制（replication）将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录（transcription）和翻译（translation），合成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了分子生物学的中心法则（centraldogma）。补充：在某些情况下，RNA也可以是遗传信息的基本携带者。如：RNA病毒能以自身RNA分子为模板进行复制；致癌RNA病毒还能通过逆转录的方式将遗传信息传递给DNA。,DNA,复制,转录,翻译,RNA,逆转录,蛋白质,复制（病毒）,.,4,第一节DNA的生物合成,DNA的自我复制逆转录作用DNA的损伤、修复和突变,.,5,一、DNA的自我复制,（一）半保留复制（semiconservativereplication）,双螺旋DNA的每一条DNA链作为模板复制一条新链，可产生两个新的双螺旋DNA分子，这两个子代DNA分子都含有一条新链、一条旧链。,与之相对是全保留复制：由复制产生的新合成的DNA链组成双螺旋分子，而亲本双链得以保留。,动画：DNAreplication,.,6,1958年Meselson和Stahl用同位素示踪和密度梯度离心的方法证明了DNA的半保留复制。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约15代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代。分别提取DNA，作密度梯度离心，将具有不同密度的DNA分离开。,DNA半保留复制的实验证明,动画：DNA半保留复制实验,.,7,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,.,8,模板底物解螺旋酶单链结合蛋白拓扑异构酶引物、引物酶DNA聚合酶DNA连接酶,（二）DNA复制的条件,.,9,DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。,1.模板（template）,.,10,以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP。,2.底物（substrate）,dNMP和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱氧核苷三磷酸。,.,11,解螺旋酶（helicase），又称解链酶，是用于解开DNA双链的酶蛋白。大肠杆菌有4中解螺旋酶，即解螺旋酶I、II、III和Rep蛋白，其中Rep蛋白是最主要的解螺旋酶。每解开一对碱基，需消耗2分子ATP，依靠水解ATP提供解链所需要的能量。,3.解螺旋酶,.,12,单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB），是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。,4.单链DNA结合蛋白,使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,.,13,.,14,5.DNA拓扑异构酶,引起拓扑异构反应的酶称为拓扑异构酶（topoisomerase）。DNA复制时模板DNA超螺旋的松弛和复制后超螺旋的再恢复都需要拓扑异构酶的参与。,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA分子中存在打结，缠绕、连环的现象。,.,15,按照作用机制，拓扑异构酶可分为I、II两种类型。,动画：拓扑异构酶,.,16,拓扑异构酶II也叫旋转酶（gyrase），在有ATP功能的情况下，可引入负超螺旋，可消除复制叉前进时产生的扭曲张力，它和拓扑异构酶I一起共同控制着DNA的拓扑结构。,.,17,引物酶（primase）本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶，该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物（primer），以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。,6.引物、引物酶,在E.coli中，含有DnaB蛋白、DnaC蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体（primosome）。,.,18,许多与DNA复制直接相关的基因被称为dna基因；不过也有其他不同的名称。与复制相关的基因：dnaA、dnaB、dnaX相应的基因产物：DnaA、DnaBDnaXDnaA：辨认复制起始点oriC（originC）；DnaB：引发体的组分，具有解螺旋酶的活性；DnaC：引发体组分，帮助DnaB结合于起点；DnaG：引物酶，合成前体片段的引物。,.,19,引物酶催化合成短链RNA引物分子,RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,.,20,7.DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase，DDDP），简称：DNA-pol活性：1.53的聚合酶活性；2.核酸外切酶活性,DNA聚合酶催化DNA链的延长,.,21,核酸酶：作用于核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶，按其作用位置分为:1.核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3端或5端），逐个水解下核苷酸。脱氧核糖核酸外切酶：只作用于DNA；核糖核酸外切酶：只作用于RNA。2.核酸内切酶：从核酸分子内部切断3，5-磷酸二酯键。,限制性内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶，可用于特异切割DNA，常作为工具酶。,.,22,在原核生物中，主要的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶I（polI），DNA聚合酶II（polII），DNA聚合酶III（polIII），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。1999年发现DNA聚合酶IV、V。参与DNA复制的主要是polIII和polI。,（1）种类和生理功能,.,23,DNA聚合酶I：主要功能是参与DNA修复，切除RNA引物并填补其留下的空隙缺口。DNA聚合酶II：主要功能可能是参与DNA的损伤修复。（具体不祥）DNA聚合酶III：是催化大肠杆菌DNA复制主要的酶。,.,24,原核生物中的三种DNA聚合酶,.,25,真核生物的DNA聚合酶,.,26,为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1遵守严格的碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3对复制过程中出现的错误及时进行校正。,（2）DNA复制的保真性（fidelity）,.,27,DNA-polI的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-polI的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-polI不表现外切酶活性。,.,28,DNA连接酶（DNAligase）可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,8.DNA连接酶,DNA连接酶的连接作用,DNA连接酶催化的条件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭的切口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,.,29,DNA连接酶在复制中起最后接合切口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶的作用,.,30,（三）原核细胞的DNA复制过程,复制的起始链的延长链的终止,以大肠杆菌染色体（闭环的DNA分子）复制为例。,.,31,DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（origin）。在原核生物中，复制起始点通常为一个。大肠杆菌复制原点的碱基序列是高度保守的。关键序列是两组短的重复：3个13bp的重复序列和4个9bp的重复序列。,1.复制的起始点和方向,大肠杆菌复制原点OriC中的特殊序列,.,32,DNA复制时，以复制起始点（origin）为中心，向两个方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制（bidirectionalreplication）。但在低等生物中，也可进行单向复制。,双向复制,.,33,E.coli染色体DNA复制：复制时有一个复制起点，双向展开，形成状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称复制。,.,34,真核细胞基因的线状DNA上含有多个复制起点，是多复制子的。,真核细胞DNA链较原核生物长很多，聚合速度又较慢，如何解决？,.,35,习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子（replicon）。复制子是独立完成复制的功能单位。DNA复制时，在复制的起始点处，DNA双链部分解开为单链，形成叉子形状，这种叉状结构称为复制叉（replicationfork）。,.,36,复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,.,37,大约20个各带1个ATP的DnaA蛋白结合到9bp的重复序列上，DNA缠绕在上面，形成起始复合物（initialcomplex）。HU复合物是类组蛋白，可与DNA结合，促进起始，受其影响，邻近的3个13bp重复序列被变性成开放复合物，即解链而形成一小段单链，所需能量由ATP供给。DnaB在DnaC的帮助下结合于解链区，DnaB借助水解ATP产生的能量，沿DNA链53方向移动，解开DNA的双链。再与引物酶（DnaG蛋白）组装成引发体（primosome），以备引物和DNA的合成。,起始的过程,.,38,DnaB（解旋酶）、DnaA和DnaC参与解链，形成复制叉（replicationfork），SSB结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成引发体（primosome），并合成RNA引物，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶II实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。,.,39,.,40,2.复制的延长,复制的延长指在DNA聚合酶催化下，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶III。,.,41,复制起点解开后形成2个复制叉，进行双向复制。当复制叉沿DNA模板向前移动时，新生成的DNA方向与复制叉移动方向相同吗？,半不连续复制,.,42,DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是35。由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。,半不连续复制,.,43,在DNA复制时，以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，延伸方向与复制叉的移动方向相同，这一条链被称为前导链（leadingstrand）。以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，由许多53的DNA片断组成，延伸方向与复制叉的移动方向相反，这条链被称为滞后链（laggingstrand）。滞后链上的每一段DNA短链称为称为冈崎片段（Okazakifragment）。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制的半不连续性。,.,44,前导链先由引物酶在起点处合成一段RNA引物，随后DNApolIII即在引物上加脱氧核苷酸。前导链的合成与复制叉的移动同步。,.,45,滞后链的合成是分段进行的，需要不断合成冈崎片段的RNA引物，然后由DNApolIII加入脱氧核苷酸。,引发体主要在DNA滞后链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3-OH末端接下去合成DNA片段，这就是滞后链不连续合成的开始。,.,46,由于DNA的两条互补链方向相反，为使滞后链能与前导链被同一个DNApolIII不对称二聚体合成，滞后链必须绕成一个环状（loop）。,DNA聚合酶III全酶是一个具有双活性位点的非对称的聚集体，催化前导链和滞后链的同时复制,.,47,（1）去除引物，填补缺口（gap）：在复制过程中形成的RNA引物，需由DNA聚合酶I（53外切酶活性）来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶I（原核生物）或DNA聚合酶（真核生物）催化延长缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。（2）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,.,48,大肠杆菌环状DNA，在oriC区染色体是双向复制，形成两个背道而驰的复制叉，当两个复制叉碰在一起时，复制终止。两个复制叉最终相遇在有多重拷贝的Ter序列的终止区域。Ter序列长20bp，是终点利用蛋白（即Tus蛋白）的结合位点。Tus蛋白结合在终止位点有助于阻挡移动的复制叉。Tus-Ter复合物，能够停止先期到达的复制叉的推进，等待后期到达的复制叉，使两者总能相遇，完成复制。,3.复制的终止,.,49,DNA的复制过程,动画：DNA复制,.,50,复制的起始（1）复制原点：OriC序列，富含AT（2）DNA解链酶解开双链DNA（3）SSB结合于DNA单链（4）DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力（5）DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物复制的延伸：（6）DNA聚合酶在两条新生链上同时合成DNA（7）DNA聚合酶切除RNA引物，并补上DNA（8）DNAligase连接一个冈崎片段复制的终止：（9）形成Tus-Ter复合物,DNA复制过程小结,.,51,（四）真核细胞的DNA复制,（自学）,.,52,1970年有人从致癌RNA病毒中发现了依赖于RNA的DNA聚合酶（RNA-dependentDNApolymerase）或称RNA指导的DNA聚合酶（RNA-directedDNApolymerase），即逆转录酶（reversetranscriptase，RT），能以RNA为模板合成DNA。这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的过程相反，故称为逆转录（ReverseTranscription）。反转录酶的发现使中心法则更完善。,二、逆转录作用,DNA,转录,RNA,逆转录,复制（病毒）,.,53,（一）逆转录酶以病毒RNA为模板合成cDNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象：,逆转录酶具有:依赖于RNA的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H活性（降解RNA活性）依赖于DNA的DNA聚合酶活性,逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA（complementaryDNA，cDNA），它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体；随后又在逆转录酶的作用下，水解掉RNA链；再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。,.,54,携带逆转录酶的病毒称为逆转录病毒或还原性病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠逆转录酶催化合成DNA，随后这种DNA环化并整合（integration）到宿主细胞的染色体DNA中去，以前（原）病毒（provirus）的形式在宿主细胞中一代代传递下去。,.,55,逆转录病毒的生活周期,动画：逆转录,.,56,（二）逆转录病毒引起癌症或艾滋病,许多逆转录病毒进入细胞后，通过逆转录整合到宿主的染色体上并随之同步复制。某些逆转录病毒上带有致癌基因（oncogene），可引起宿主细胞分裂失控和生长异常，形成肿瘤或癌症。,.,57,获得性免疫缺陷综合症（acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS），是由人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染而引起的以T淋巴细胞免疫功能缺陷为主的一种免疫缺陷病。HIV病毒是一种逆转录病毒，不使宿主细胞发生癌变，而是破坏人体的免疫细胞，使人体产生免疫缺陷。,治疗：抑制逆转录酶活性是艾滋病治疗研究的重要靶酶。核苷类似物：竞争性抑制HIV-1逆转录酶活性，并在逆转录中终止cDNA链延伸，如3-叠氮脱氧胸苷（AZT），在逆转录酶合成病毒DNA时，ATZ掺入到病毒DNA中，由于AZT无3-OH，所以使病毒DNA合成终止。,.,58,逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,.,59,三、DNA的损伤、修复和突变,DNA受到自然因素或诱变因素作用，结构会出现不同程度的损伤或产生突变；生物体中存在有特殊的修复系统，可以对某些损伤进行适当的修复。,.,60,（1）自发因素：自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,引起DNA损伤的因素,（一）DNA损伤,.,61,（2）物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,胸腺嘧啶二聚体的形成,.,62,（3）化学因素：脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成H。,.,63,烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。碱基类似物：如5-FU等可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,.,64,（二）DNA修复系统是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。,光复活（photoreactivation）切除修复（excisionrepair）重组修复（recombinationrepair）SOS修复（SOSrepair）,修复的主要类型：,.,65,能够修复由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。修复过程由光裂合酶（photolyase）催化完成。,（1）光复活（photoreactivation）,其修复过程为：光裂合酶识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。在400500nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开。光裂合酶从DNA上解离。,.,66,这是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除，然后再以对侧链为模板，重新合成新链进行修复。,（2）切除修复（excisionrepair）,.,67,在原核生物中，与DNA切除修复有关的蛋白质包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNApol和DNA连接酶。UvrA和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作用；而UvrC则主要与受损片段的切除有关。,原核生物DNA切除修复的机制,.,68,又称为复制后修复。修复时，利用重组蛋白RecA的核酸酶活性，将另一股完整的亲链与损伤缺口相互交换。在E.coli中参与重组修复的酶：RecA、RecB、RecC、DNApolI和连接酶。,（3）重组修复（recombinationrepair）,.,69,（4）SOS修复（SOSRepair）,SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复（errorpronerepair），使细胞有较高的突变率。属于紧急修复。当DNA两条