rt-qPCR实验操作ppt课件

荧光实时定量PCRrt-qPCR,1,定义实时荧光定量PCR(rt-qPCR)：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。,2,Rt-qPCR的应用,mRNA表达的研究微小残留病变的检测肿瘤耐药基因表达的研究病毒感染的定量监测,3,PCR基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据1.DNA半保留复制的机理2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质通过人为控制体外合成系统的温度，使1.双链DNA变成单链2.单链DNA与人工合成的引物退火3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,4,基本步骤变性：加热使双链DNA变为单链（94，30s）退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链（55，30s）延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应（7072，3060s）,5,示意图,6,Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测和连续地分析整个PCR进程，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的分析。,7,SYBRGreen,SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位，只有和双链DNA结合后才发出荧光，DNA双链分开就不发出荧光，随PCR循环数的增加，产物量的增多，产生的荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关联。,8,理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗，最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系（PCR产物量=初始模板量2N，N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期，PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多少是不准确的。,9,在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里目标基因片段的含量，记录每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就说明目标基因在原本的样品里越少，即初始模板的量越少。,10,logX=n(1+E)+logX0,11,实验步骤,1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因和使用的内参序列，排好板的顺序。2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化，离心。3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每个孔加前后引物各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合样本，sybr，水。按比例混合前后引物。4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4微升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物，每孔1.6微升。5、贴膜，离心，上机，RealTimePCR扩增结束后输出对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。,12,即实验组基因表达相较于对照组上调或下调的倍数。,13,荧光定量PCR如何减小误差,1、校准生物学误差：内参(管家基因)2、降低随机误差,14,1、校准生物学误差内参(管家基因),内参基因(EndogenousControl)用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成等量样品不一定获得等量提取物目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为单位，不同样品之间才具有可比性校