基因工程制药

泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,第四节基因表达,基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系是基因表达设计的关键。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,选择原则：容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA技术操作；产物的产量、产率高，且易提取纯化。,一、宿主细胞的选择,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。1、原核细胞（1）大肠杆菌：表达产物的形式：细胞内不溶性表达（包涵体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少还可分泌到胞外表达。不同的表达形式具有不同的表达水平，且会带来完全不同的杂质。,一、宿主细胞的选择,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,特点:A、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难。B、由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体(inclusionbody)，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,C、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质，在应用上受到一定的限制。由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,（2）枯草芽孢杆菌：分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行不同程度的降解，因此，它的应用也受到限制。（3）链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全，分泌能力强，可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力，可做理想的受体菌。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,2、真核细胞（1）酵母：繁殖迅速，可廉价的大规模培养，而且没有毒性，基因工程操作与原核生物相似，表达产物直接分泌到细胞外，简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因，在酵母中表达良好。（2）丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠，有成熟的发酵和后处理工艺。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,（3）哺乳动物细胞：由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，培养液成分完全由人控制，从而是产物纯化变得容易。产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。但动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。虽然从理论上讲，各种微生物都可以用于基因表达，但由于克隆载体、DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,二、外源基因在大肠杆菌中的表达,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,（一）表达载体,表达载体必需具备的条件；问题:阻遏子repressor的阻遏作用对hostcell有何影响？对foreigngene的表达有无影响？常用载体：PBV220系统PET系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,（二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架；基因克隆表达系统成熟完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物；,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,E.coli基因组概况,E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333um。1997年测定完成E.coliK-12MG1655菌株全基因组:4,639，221（约4.7106）bp其中：87.8编码蛋白质0.8编码稳定性RNA0.7%无编码功能的重复序列11属调节序列和具有其它功能在编码蛋白质序列：总共编码4405种已知和未知的蛋白质（可读框），其中约38功能不明。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,在K-12MG1655菌株中，基因的平均长度为950bp,基因之间的平均间隔约为118bp，但是菌株之间可能会有很大的差别。2005年报道了第二个菌株E.coliK-12W3110基因组的完整序列。比较K-12MG1655菌株和K-12W3110菌株，发现两者基因组大小并不是一致的。K-12W3110基因组大小为4，646，332bp基因总数为4464个K-12W3110与K-12MG1655两者相同的基因为4453个。,E.coli基因组概况,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,（二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征,大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能；缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；细胞周质内含有种类繁多的内毒素。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,（三）各种类型表达系统的构成及特点,Lac、Tac表达系统Trp表达系统PL和PR表达系统T7表达系统其他类型的表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP负调节因子lacI,Lac表达系统,以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,Lac表达系统正调节因子CAP:cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与35、10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,Lac表达系统负调节因子lacI:无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,lacIPlaclacOlacZlacYlacA,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,tac启动子是由trp的35序列和lacUV5的10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。,Tac表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。,lac、tac启动子对宿主菌的要求,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。,lac、tac启动子对宿主菌的要求,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG解决方法lac和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录,lac、tac表达系统存在的问题,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,lac和tac启动子的转录受温度严紧调控把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30）时抑制，在较高温度（42）时开放。用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录,lac、tac表达系统存在的问题,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,转录调控机理色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达。,Trp表达系统,以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,Trp表达系统,PtrpOtrp,PtrpOtrp,PtrpOtrp,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,Trp操纵子的衰减调控,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,转录调控的机理由噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度（30）时以活性形式存在在较高温度（42）时失活脱落,PL和PR表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,对宿主菌的要求用溶源化噬菌体的大肠杆菌作PL、PR启动子表达载体的宿主菌:N4830-1，POP2136等菌株已经溶源化cI857(ts)l噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。把cI857(ts)基因组装在表达载体上:宿主菌选择范围更大,PL和PR表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,缺陷在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30提高到42需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。,PL和PR表达系统存在的问题,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,pET系列载体是这类表达载体的典型代表，以后出现的载体都是在它的基础上发展起来的。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右且可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因转录达到很高的水平。,T7表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。化学诱导型温度诱导型双质粒系统,T7表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,化学诱导型转录调控的机理噬菌体DE3是噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。,T7RNA聚合酶基因,lac启动子,E.Coli（DE3）,IPTG诱导,T7表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,温度诱导型转录调控的机理PL启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。,T7RNA聚合酶基因,PL启动子,E.Coli（CE6）,热诱导,cI857,T7表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,双质粒系统转录调控的机理一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因。两个质粒的复制子和抗性标记不能相同，调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型。,热诱导,T7表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决办法之一在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。,T7表达系统存在的问题,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,溶氧调控型大肠杆菌GJ100有透明颤菌血红蛋白基因（vgb）启动子控制下的T7RNA聚合酶基因表达质粒，vgb基因的转录是受环境溶氧浓度调控的，在贫氧条件下vgb基因的启动子被激活。因此，用大肠杆菌GJ100作为宿主时，表达系统调控方式为贫氧诱导型，菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量加以调节，与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。,其他表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,溶氧调控型采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl启动子，硝基还原酶基因nirB启动子或透明颤菌血红蛋白基因vgb启动子构建表达载体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子fnr的作用位点。在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微氧条件下转录被激活。,其他表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,营养调控型采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因phoA启动子或甘油3-磷酸转移系统ugp启动子构建表达载体。这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi5mmol/L时抑制，Pi1mmol/L时激活，具有较高的转录水平。,其他表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,糖原调控型采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC)mgl启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB启动子构建表达载体。这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于Lac表达系统。,其他表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,pH调控型采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA启动子构建表达载体。cadA启动子受培养基中H+浓度，即pH值调控。（在pH8时抑制，pH6时激活，pH=6时转录活力最高）。该表达系统要求菌体发酵温度控制在2730之间才能使目的基因得到稳定的表达.,其他表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,生物素调控型用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体，菌体生长过程中生物素会不断消耗，当浓度到达2ng/ml以下时启动子被激活。能够在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导表达目的基因是这类表达载体的特点，其缺陷是不容易精确控制自动诱导的时刻。,其他表达系统,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,（四）外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,大肠杆菌高效表达真核基因,涉及到三方面强化蛋白质的生物合成主要为外源基因剂量（拷贝数）、基因转录水平、mRNA翻译速率的时序性控制，这种控制是在重组分子构建过程中通过相应表达调控元件的精确组装来实现抑制蛋白产物降解维持或恢复蛋白质特异空间构象,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,优化表达调控元件，应考虑以下方面1、转录启动子和终止子的特点2、核糖体结合位点的强弱3、基因拷贝数及其是存在于质粒中，还是整合到寄主基因组中4、合成的外源蛋白在细胞中的定位5、寄主的翻译效率6、所表达的蛋白在寄主中的自身稳定性,（四）外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数,（四）外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,最佳启动子应具备的条件？1、强启动子能使克隆基因的表达蛋白占细胞蛋白总量的10-30以上。2、能呈现低限的基础转录水平在表达毒性蛋白质或有损于寄主生长的蛋白质时，使用高度抑制型的启动子。3、诱导型启动子能通过简单的方式或廉价的诱导物得以诱导。,启动子,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子,启动子最佳距离的探测,T4-DNALigase,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子,启动子的分离1、将目标原核细胞的染色体DNA用某一种限制性内切酶切成小的DNA片段2、将这些DNA片段分别插入到一个缺乏自身启动子的报告基因的上游3、通过抗性筛选表达强度高的克隆4、对报告基因前的插入DNA片段进行分析，即可得到活性启动子,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子,启动子的筛选1、采用鸟枪法战略：将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上，受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,采用galK为报告基因的pKO1载体系统优点1、可以根据转化子细胞中半乳糖激酶的产量的多少，鉴定启动子的强弱2、根据在麦氏培养基中的菌落颜色特征，分离功能启动子,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子,启动子的筛选2、酶保护法分离：RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合；3、滤膜结合法分离：双链DNA不能和硝酸纤维薄膜有效结合，而复合物在一定条件下可以结合在膜上。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子的保守序列,启动子的构建,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子的可控性,乳糖启动子Plac的可控性：野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高。,乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子的可控性,葡萄糖代谢,CAP,cAMP,cAMP浓度降低,PlacUV5,O,高效转录,P,O,P,O,阻遏蛋白,诱导,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子的可控性,色氨酸启动子Ptrp的可控性：色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,启动子的可控性,噬菌体启动子PlL的可控性：噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋白在42时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达。但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,双质粒表达系统,用trp启动子驱动编码cI阻遏蛋白的基因，然后将他们置于一个低拷贝的质粒上；将需要表达的基因置于PL启动子的下游，使其表达受PL启动子的调控。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,双质粒表达系统,采用这种双质粒系统，细胞可以用很便宜的含糖浆（molasses）及酪蛋白水解物的培养基进行培养，这种培养基只含有少量游离的色氨酸。在进行诱导时，向培养基中加入蛋白胨，它含有足够的色氨酸。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌的能量消耗；过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，降低外源基因的翻译效率。,终止子,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用；终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。,终止子,筛选Apr、Tcs的转化子,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,在pCP1四环素敏感的重组子中克隆的DNA片段并非真正的终止子序列？,1）杂合mRNA中的克隆片段对应的RNA序列影响二级结构的形成，降低转录物的稳定性和翻译效率；2）克隆DNA仅含有终止密码子，但报告基因能正常转录但难以表达出抗性蛋白；3）杂合mRNA分子翻译出融合蛋白影响四环素抗性蛋白的生物活性。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,核糖体结合位点,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,核糖体结合位点,核糖体结合位点的结构大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5UAAGGAGG3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3端区域3AUUCCUCC5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子；SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；基因编码区5端若干密码子的碱基序列。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列的影响一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列与起始密码子之间的序列的影响：SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响起始密码子及其后续若干密码子的影响：大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，其序列和间隔是最佳的。,泰山学院生物工程与酿酒学院,生物技术制药朱红艳,生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱