生物工程下游技术电泳

Chapter8电泳技术Electrophoresis,8.1概念8.2电泳的基本原理与分类3.3各种电泳技术,电解质在电场作用下发生定向泳动的现象。荷电的胶体粒子在电场中的移动；电泳分离：利用电解质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。属速度分离法(无平衡现象)。电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。,8.1概念,蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。,8.1电泳的基本原理与分类,8.1.1电泳的基本原理,StokesLaw（斯托克斯定律）,如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，它们与介质的摩擦阻力f相抗衡，这种抗衡服从斯托克斯定律：f=6rvv是介质粘度为中半径为r的颗粒的移动速度。但实际情况中，f还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至是介质的内渗等。,电泳迁移率,电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。其单位是cm2sec-1V-1电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础,8.1.2电泳的大致分类,依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis）又称自由界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。,区带电泳（zoneelectrophoresis）是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。,按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。,淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质,另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量、免疫电泳。,稳态电泳（steadystateelectrophoresis）其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。,区带电泳的主要技术,具有支持介质的区带电泳具有防止电泳过程中的对流和扩散，可使被分离的成分得到最大分辨率的分离；区带电泳中的常用技术载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳,8.3.1凝胶电泳,作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。凝胶电泳的支持介质：聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PGA）由丙烯酰胺和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接的-D吡喃半乳糖和1，4连接的3，6脱水-D吡喃半乳糖交替形成的；,8.3各种电泳技术,丙烯酰胺的聚合,丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素（引发剂）来引发该过程；以N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下，产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物；,影响聚合的主要因素,引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在4060分钟内完成。系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果；温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性；分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；,聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应,在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（sizesievingcapacity），这种现象被称为分子筛效应（molecularsievingeffect）,分子筛效应,A,B,C,图中A，B，C均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为MA=MBMC，所带电荷量相同QA=QB=QC。,+,-,琼脂糖凝胶的性能、结构与特点,其优点如下：琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶电泳低。机械强度高：可以在浓度1%以下使用；无毒；染色、脱色程序简单，背景色较低；热可逆性；生物中性：一般不与生物材料结合；电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益,电泳新介质,N-取代聚丙烯酰胺介质：Poly-N-acryl-tris(NAT)gelN-AcryloylsugarsAcryloylmorpholineHydrolinkgelsN-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE),特点：,具有极强的水解稳定性具有高度亲水性孔径大,电泳系统的基本组成,电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200600V，载体两性电解质等电聚焦电泳10002000V，固相梯度等电聚焦30008000V外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却；凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥；灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子；电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如PVDF膜,电泳洗脱仪：回收样品凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。,垂直电泳槽及灌胶模具,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理：由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳,电泳前的准备工作,缓冲系统的选择：（1）保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持；（2）电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pH应限制在310之间。,缓冲系统的选择原则,是两种标准的对立权衡（1）如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短，区带细而窄；（2）如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率就高；因此，常常选择pH8.09.5的缓冲，常用的缓冲液有Tris-甘氨酸（pH8.39.5），Tris-硼酸(pH8.39.3)和Tris-醋酸（pH7.28.5）,离子强度的选择,离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。一般选择缓冲液的离子强度为0.010.1mol/L之间,凝胶浓度的选择,由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为：（1）非排阻性凝胶（unrestrictivegel）:浓度0.71.0%的琼脂糖凝胶；（1）排阻性凝胶（restrictivegel）：浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE,凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置；凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离；,凝胶浓度与分子量测定的关系,PAGE的具体操作过程,制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（12mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；电泳：46小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色灵敏度比考染高100倍、荧光探针）；照相、凝胶干燥：定量测定：,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应,蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。,SDS-PAGE的原理,蛋白质分子的解聚SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。,蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变,未知蛋白质分子量的测定,基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；,SDS-PAGE电泳后的样品活性恢复,SDS-PAGE电泳的操作步骤与常规PAGE电泳基本类似；但由于SDS-PAGE电泳后，样品已经变性。所以，去除SDS后，蛋白质的活性恢复十分重要；一般来说，SDS不一定会导致不可逆变性但有许多因子会影响活性的恢复（纯度、蛋白酶的影响）,样品活性恢复方法,在凝胶中恢复活性只有单体蛋白、有相同亚基组成的蛋白才能够使用这种恢复方式；异丙醇、醋酸、水（5/2/13）去除SDS，然后以缓冲清洗；电泳转移后恢复活性电泳转移后，再进行一次连续电泳便可去除SDS，而蛋白则留在膜上；洗脱后，在自由溶液中恢复活性尿素、透析袋,8.3.2载体两性电解质pH梯度等电聚焦,等电聚焦（isoelectrofocusing）,IEF利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。,工作原理,蛋白质的等电点蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该蛋白的等电点（isoelectricpointpI）。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析,载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理,载体两性电解质pH梯度等电聚焦就是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。,常规PAGE和等电聚焦电泳的区别,载体两性电解质和pH梯度的形成,等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立载体两性电解质的概念：作为载体两性电解质应该具有以下特点：（1）应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置；（2）应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。,用于等电聚焦的主要载体两性电解质,Ampholine(瑞典LKB公司)由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成，它们具有连续改变的氨基与羧基比,Servalyte(德国Ser