第三章-园艺植物组织培养

第三章园艺植物组织培养,内容（4学时）,第一节概说第二节园艺植物组织培养的应用第三节园艺植物原生质体培养和体细胞杂交第四节原生质体融合与园艺植物改良,培养室,能控制光照和温度，保持干燥和清洁,园艺植物组织培养,小鳞芽反绿后开始生长生根,观赏百合组织培养,第一节概说,一、园艺植物组织培养的意义园艺植物组织培养是园艺学不可或缺的一个重要组成部分，为园艺植物的各个基础学科的研究和发展提供了强有力的手段，在园艺学的基础理论研究方面占有重要的地位，在园艺产业中具有广泛的应用前景。园艺植物组织培养技术及理论研究的发展对提高园艺植物生产水平和技术水平，加速园艺科学现代化的进程具有重要作用。,植物组织培养作为一门生物技术近30年发展迅速，广泛应用于农业、园艺、林业、医药。农业生产中进行优良植物种类的快速繁殖，脱除病毒和辅助育种等，并产生巨大的经济效益。现代农业必须用生物技术“提升”，“植物组织培养”就是用生物技术提升农业的重要科学手段。,园艺植物离体无性繁殖,简称离体繁殖（invitropropagation)、微型繁殖（micropropagation)，是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法（技术）。用这种方法得到的植株群体来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同，这些株群可称单株无性系。,近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。,园艺植物离体无性繁殖的意义（优越性）,繁殖速度快，经济效益高,占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗,繁殖各种珍稀、涉危苗木和突变体，为育种服务,离体繁殖周期：13个月繁殖系数：几十几百倍又称快繁,离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，是在人工控制的环境条件下，不会造成性状分离，也不会退化，同时还可避免病虫害的侵染。,手指玫瑰,菊花的组培快繁,（一）外植体材料选择与灭菌选取长势健壮的植株作为外植体母株，以培养出大量的无病植株。在外植体的选择上，可以选取生长健壮嫩茎和叶片作为材料。流水洗去表面灰尘，在超净工作台用75%酒精处理2030s，再用无菌水冲洗35次，转入0.1%升汞溶液浸泡710min，再用无菌水冲洗46次，用滤纸吸干水分。,（二）诱导、继代培养在无菌条件下，用剪刀将外植体茎段切成0.51cm长小段，水平放置接种；叶片切成5mm5mm小块，下表皮朝下水平放置接入初代培养基中，接种完成后即转入培养室进行初代培养，培养温度2228，光强10004000Lx。,1.间接再生途径茎段和叶片接种到培养基上，均可以从一周内，明显可以看到茎段和叶片开始膨大。20d后产生愈伤组织，30d愈伤组织分化出芽。2.直接再生途径茎段和叶片接种到培养基上，均可以从一周内，明显可以看到茎段和叶片开始膨大。但是20d后不产生愈伤组织，直接分化出芽。,菊花再生植株,（三）生根、移栽当培养基中的植株出芽后，再将其转入到生根培养基中，诱导其生根。或通过无根嫩茎扦插生根。,1.试管生根切取3cm左右无根嫩茎，转插到1/2MS+NAA0.1培养基中，经两周即可生根，然后移栽驯化。移栽初期保持高湿度条件，营养钵基质浇透水，取出生根的试管苗，洗掉附加在根部的培养基，用竹签在基质上打一小孔，将幼苗插入基质中。然后家设小拱棚以保湿，随着幼苗的生长，逐渐降低空气湿度和基质含水量，转为正常的管理阶段。,2.扦插生根利用菊花无根嫩茎易于生根的特点，也可免去试管生根这道程序。剪取23cm无根苗，插植到珍珠岩或蛭石的基质中，基质事先用生根激素溶液浸透，10d后生根率可达95%100%。,菊花炼苗,菊花移栽苗,园艺植物离体无性繁殖的方式,器官发生型(organogenesistype)胚状体发生型(embryogenesistype)不定芽型（adventitiousbudtype)器官型(organtype)原球茎型(protocormtype)球茎芽型块茎型鳞茎型孢子型根茎型微枝扦插型,器官发生型(organogenesistype)：,诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致。特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。,芦荟、烟草、油菜等,无菌母株制备,增殖、分化,植株再生及鉴定,炼苗和移植,培养基中激素配比,激素种类及浓度,基本培养基组成,渗透压,逐步过渡,培养基筛选,材料灭菌,芦荟组织培养快速繁殖,材料和培养基1015cm高的芦荟幼苗愈伤组织诱导培养基MS(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA分化培养基MS(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA生根培养基MS(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)多效唑,繁殖方法,愈伤组织培养外植体：茎尖外植体消毒：酒精升汞培养基：愈伤组织诱导培养基培养条件：温度252光照10002000lx1012h/d培养时间1525d（形成愈伤）,繁殖方法,继代培养种子愈伤切块培养基及条件同愈伤组织培养培养时间1030分化培养种子愈伤切块培养基分化培养基培养条件同愈伤组织培养培养时间3050d（出芽，叶）,生根培养材料3cm高的幼苗培养基生根培养基培养条件同愈伤培养培养时间15d炼苗选材苗高510cm，健壮清洗培养基，喷水条件1525，6080湿度，1224h移栽移入驯化苗圃（蛭石组成）1520d移入苗圃,胚状体发生型(embryogenesistype)：,指园艺植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。,甘蔗、胡萝卜、石刁柏等,胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。,合子心型胚正在萌发的体胚,合子胚与体胚比较,针叶松体细胞胚及体胚萌发生长,花椰菜体胚发育的不同阶段,菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察,不定芽型（adventitiousbudtype)：,选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植株的方式。技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根。特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。,器官型(organtype),指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生。优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。,三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等,原球茎型(protocormtype),兰属特有的方式，即外植体经培养产生原球茎，再直接长成植株。,原球茎：兰科植物组织培养中形成的一种特殊的中间繁殖体，是呈珠粒状、由胚性细胞组成、基部生假根、类似嫩茎的器官。圆球茎可以增殖形成原球茎丛。,球茎芽型,叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根,遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植,唐菖蒲,观叶海棠,块茎型,叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高。花叶芋,鳞茎型,鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎在试管内形成小鳞茎需较长时间百合郁金香,孢子型,用成熟或未成熟的孢子进行培养孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长地钱,狼尾蕨,根茎型,蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体。根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快肾蕨等,微枝扦插型,带芽的小插条在试管内进行无菌扦插为木本植物进行快速繁殖的主要方式葡萄、杨树,1、快繁利用适宜的植物材料(外植体)，通过组织培养的途径，使之分生出新的植株个体，即为组培苗。这种繁殖方式称为微繁或快繁。,二、园艺植物组织培养的意义,微繁有许多优势,繁殖速度快，通常一年内可以繁殖数以万计的，较为整齐一致的种苗，大大提高繁殖系数。特别对于难繁殖的园艺植物的名贵品种、稀有种质的繁殖推广具有重要意义。一个兰花的茎尖一年内可育成400万个原球茎，一个草莓茎尖一年内可育出成苗3000万株。占用空间小，一间30平方米的培养室可以放置一万多个瓶子，足以同时繁殖几万株种苗。可以培养脱毒种苗。器官培养为无性繁殖，可以最大限度的保存种质。,（1）培育单倍体,提高育种效率，改良品种,花药培养：把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程花粉培养：从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程,目的是获得单倍体植株迅速获得纯合型材料，缩短育种年限获得育种中间材料与诱变育种相结合可以提高诱变频率与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义作为遗传工程受体更为有效用作基础遗传研究的各个领域,培养方法花药看护培养花粉悬浮培养固液双层培养,花粉或小孢子的分离,花粉或小孢子培养,7天,14天,21,30,40后,曼陀罗的花药培养,一、胚培养的类型：分为成熟胚培养和幼胚培养两种。,(2)园艺植物胚与胚乳培养,第四章胚胎培养和胚乳培养,被子植物双受精（doublefertilization):二倍体合子三倍体胚乳幼胚培养:Hanning（1904）；Laibach（1925）最先付诸应用的植物细胞工程技术：20世纪20年代建立的幼胚培养和胚胎拯救（embryorescue)技术,中国学者在裸子植物胚胎培养方面的工作,1934清华的李继侗和沈同发现银杏胚乳提取物可刺激离体胚生长1941VanOverbeek发现椰乳对幼胚发育的促进作用1943罗士韦和王伏雄在Science发文章，离体培养云南松和云南杉幼胚成功。,胚乳培养的意义,胚乳：三倍体胚乳细胞中储存大量淀粉、蛋白质和脂类，是研究这些产物代谢工程的理想系统完全由薄壁细胞组成的均质组织，是实验形态发生学研究的极好材料。胚乳植株三倍体，高产、优质、果实无籽1940LaRue最先培养胚乳1970Bhojwani白花寄生获得胚乳植株1977，1978母锡金王大元,第一节胚胎培养,一、成熟胚培养盾片在胚吸收营养上有重要作用胚胎培养可以解除种皮抑制作用MS适用于多种植物成熟胚培养成功例子：杂种桃成熟胚培养与新品种培育,植物胚胎的发育时期,二、幼胚培养幼胚在胚珠中异养，离体培养必须提供足够的营养和适宜的条件。双子叶植物胚胎的发育时期：合子（zygote），二细胞原胚（two-celledproembryo），球形胚（globularembryo），心形胚（heart-shapedembryo），鱼雷形胚（torpedo-shapedembryo），拐杖形胚（walking-stick-shapedembryo），倒U形胚（invertedU-shapedembryo），成熟胚（matureembryo）心形胚以后的双子叶胚较易培养，球形胚很难培养。单子叶植物胚胎的发育时期与双子叶植物有很大不同。,幼胚的培养,常用培养基：Nitsch、MS、1/2MS禾谷类也用N6和B5幼胚培养需要的蔗糖浓度高于成熟胚，可用代谢上惰性的甘露醇部分代替蔗糖来调节渗透压。VB1和生物素对胚胎发育有重要作用。一般不需要外用激素。八分成熟的椰乳对幼胚促进最明显。胚乳看护培养（nurseculture）弱光或黑暗培养,防止幼胚的提前萌发,幼胚的提前萌发：未成熟胚在培养基上未发育为成熟胚，而提前生长为瘦弱和畸形幼苗的现象。抑制幼胚提前萌发的因素：提高培养基中蔗糖浓度（10）；加入ABA（0.010.2mg/L）和酪蛋白水解物（200500mg/L）；高温（32）、强光培养。ABA可抑制幼胚吸水，使其脱水干燥，发育成熟。,操作实例和经验,双培养基大麦幼胚培养基：B51/2MS无机盐MS有机成分普适于各种禾谷类幼胚培养肌醇添加,胚胎培养的应用1,1、拯救杂种胚获得稀有杂种胚胎拯救：种间或属间杂交时，两个基因组表达不协调，多数情况下胚乳最先败育，胚仍然健康，可通过离体胚培养将杂种幼胚培养成植株，称为胚胎拯救。把握好胚胎拯救的时间；盾片的作用；冷处理；先诱导杂种胚产生愈伤，再分化出杂种植株。,胚胎培养的应用2,2、产生单倍体：染色体消除之后，剥离胚培养3、缩短育种周期：打破休眠4、稀有植物的繁殖：Makapuno,第二节胚乳培养和三倍体的产生,多数情况先诱导胚乳细胞增生愈伤组织，再诱导愈伤分化器官或胚状体胚和胚乳一起培养有利于胚乳愈伤形成，但之后就应去掉，免得胚愈伤与之混淆胚乳培养的应用前景：胚乳细胞分裂不规则，胚乳植株中既有三倍体，也有许多非整倍体。三倍体的经济价值：无籽果实；生物量高；品质好；获得三体以进行基因定位。,植物胚胎发生过程：原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚,球形胚前期,心型胚前期,鱼雷胚,球形胚,1、成熟胚培养成熟胚为子叶期以后的胚，其在简单的培养基上即可萌发生长。对营养条件要求不严格。主要用来繁殖不易萌发植物，或研究胚和胚乳及子叶的关系等。,台湾红豆杉成熟胚培养,牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖,2、幼胚培养方法远缘杂种胚，要在其夭折前培养。分离：先取出胚珠，剥离珠被，取出完整的幼胚，后培养。培养：胚离体培养发育时期分为异养期和自养期。在心形期转入自养生长。对于难培养的幼胚，可利用胚乳看护培养。,黄瓜远缘杂种幼胎培养,3、胚培养的应用（1）克服远缘杂交不亲和性如利用“胚胎拯救（Embryorescue）”技术获得远缘杂种。（2）打破种子休眠，缩短育种周期（3）提高种子萌发率特别是对于一些长期营养繁殖的植物种子。,4、种质保存,种质保存:利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，高活力，能通过繁殖将遗传物质传递下去。,5、进行生理生化、细胞学、遗传学等领域的基础研究,优势：（1）环境可